基于HIF-1α-VEGF-EPO信號通路探究電針干預大腦中動脈栓塞大鼠腦血管新生的機制

王 玉,劉 芳,姚曉雯,高云云,宋宗勝,唐 巍

(1.安慶師范大學體育學院體育發展研究中心,安徽 安慶 246133;2.安慶醫藥高等?？茖W校,安徽 安慶 246052;3.合肥市第一人民醫院,安徽 合肥 230061;4.界首市人民醫院,安徽 阜陽 236501;5.含山縣中醫院,徽 馬鞍山 238101;6.安徽中醫藥大學針灸推拿學院,安徽 合肥 230012)

腦卒中是中國成年人死亡和致殘排名第一的疾病[1]。缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是腦卒中的主要類型。近年來,IS的發病率持續增高,復發率及死亡率仍處于較高水平[2]。研究[3]表明,缺血半暗帶區微血管系統的重建,可為神經元損傷修復、突觸重建創造良好微環境,促進神經再生,血管新生是其重要步驟。因此,如何精確調控內源性血管新生,發揮最佳血管效應,是當前研究的重要方向。研究[4]發現,IS后,腦部缺血低氧環境可誘導低氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)-1α高表達,轉錄激活下游血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)等表達,參與血管新生,保護受損神經元。本課題組前期研究[5-8]發現,電針“百會”“水溝”“足三里”“曲池”等穴位具有雙向良性調節作用,能多途徑、多環節、多靶點調控相關通路的蛋白和基因表達,發揮保護神經血管單元的作用。本研究從血管新生角度,觀察電針療法對大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠腦缺血半暗帶區皮質HIF-1α、VEGF、EPO表達的影響,進一步探討電針治療IS的作用機制,以期為電針治療IS提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 健康SPF級3月齡雄性SD大鼠108只,體質量280～320 g,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,生產許可證號為SCXK(魯)2019-0003。適應性飼養于IVC-Ⅱ智能型獨立通風系統籠具中1周,室溫20～26 ℃,濕度45%～55%,自由攝食飲水。術前12 h禁食不禁水。實驗遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》,并獲得安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(倫理批準號:AHUCM-rats-2020006)。

1.2 試劑 蘇木素染色液(批號 718034)、伊紅染色液(醇溶性,批號 718011):珠海Baso;無水乙醇(批號 20180410)、異丙醇(批號 20171030)、二甲苯(批號 20180310):上海蘇懿化學試劑有限公司;山羊抗小鼠IgG(批號 140193)、山羊抗兔IgG(批號 202700514):北京Zsbio;HIF-1α(批號 GR80143-2):英國Abcam;VEGF(批號 A1717):美國Santa Cruz;EPO(批號 AI12183222):北京Bioss。

1.3 儀器 生物組織包埋機(型號 YB-7LF):湖北省亞光醫用電子技術有限公司;普通PCR儀(型號 K960):杭州晶格科學儀器有限公司;超微量分光光度計(型號 OD1000+):南京五義科技有限公司;華佗牌電子針療儀(型號 SDZ-Ⅳ):蘇州醫療用品有限公司。

2 方法

2.1 模型制備及分組 按隨機數字表法選取36只大鼠為假手術組,其余大鼠參照Zea Longa法[9]制備MCAO模型。大鼠稱質量后,采用1%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,待大鼠呼吸平穩、角膜反射消失后,將其四肢仰臥位固定于鼠板,于頸部進行無菌操作,然后于正中偏右0.5～1 cm處作一縱行切口,鈍性分離皮下組織,暴露頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈。電凝筆電離頸外動脈,輕拉其游離端,使之與頸內動脈成180°。動脈夾暫時夾閉頸總動脈和頸內動脈,在頸外動脈游離端作一小切口,將直徑0.28 mm魚線經切口插入,松開頸內動脈處動脈夾,當魚線插入18～20 mm微感阻力時停止插線,打結固定,松開頸總動脈處動脈夾后縫合。肌肉注射0.5 mL青霉素預防術后感染。假手術組僅分離頸總動脈,不結扎,不插魚線。術后4 h進行改良神經功能損害評分(modified neurological severity scores,mNSS)[10],2～18分視為模型復制成功。將模型復制成功的72只大鼠隨機分為模型組、電針組,每組根據治療時間分為3、7、14 d 共3個亞組,每個亞組12只。后續實驗中采用差額補充法,保證每個亞組12只大鼠。

2.2 干預方法 電針組術后4 h進行首次電針治療。參照大鼠穴位圖譜[11]和《實驗針灸學》[12],選取“百會”(向前斜刺2 mm)、“水溝”(沿鼻中隔方向斜刺3 mm)和左側“后三里”(即“足三里”,直刺7 mm)、“曲池”穴(直刺4 mm)針刺。將電子針療儀接于毫針針柄,“百會”“水溝”為一組,左側“后三里”“曲池”一組,近心端穴接正極,遠心端穴接負極。疏密波,頻率5～100 Hz,輸出電流1～2 mA,刺激時間20 min,強度以針體微抖動、腧穴局部微顫、大鼠能耐受為度,每日1次,治療3、7、14 d。假手術組、模型組僅同等抓取固定,不干預治療。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 mNSS評估大鼠神經功能缺損情況 采用單盲法,由同一未知實驗內容、熟練掌握mNSS方法的實驗人員對各組大鼠術后4 h,3、7、14 d的運動、感覺、反射和異?；顒?個方面行為進行評分,最高18分,最低0分。評分越高表示神經損傷越嚴重。

2.3.2 多普勒超聲測定大鼠局部腦血流量(regional cerebral blood flow,rCBF) 于插線后5 min及干預3、7、14 d后測量大鼠rCBF。麻醉大鼠、剃除右顳側大腦中動脈區域被毛,將牙科鉆定位于冠狀縫向顱骨后部4 mm,距矢狀縫兩側3 mm處磨薄顱骨,鉆出半徑約1 mm的圓孔,暴露腦組織。將激光多普勒探頭用生物速凝膠固定于硬腦膜,調試儀器檢測和記錄大鼠rCBF。

2.3.3 蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察大鼠腦組織病理學改變 每個亞組隨機抽取3只大鼠,麻醉后固定,開腹暴露心臟,將灌注針經左心室插入升主動脈,并在右心耳處開一小口,用0.9%氯化鈉注射液快速沖灌,至右心耳流出液無血色,改用4%多聚甲醛固定液灌注至大鼠頸部和前肢僵硬時停止。灌注后斷頭取腦,制成厚約4 μm石蠟切片,常規HE染色,光學顯微鏡下觀察腦組織病理學變化。

2.3.4 免疫組織化學法檢測缺血半暗帶區皮質CD34陽性細胞數 將CD34一抗、二抗加入上述石蠟切片,孵育、顯色和封片。光學顯微鏡下以細胞內棕黃色顆粒沉著為CD34陽性表達。隨機選取5個視野的平均計數為缺血半暗帶區皮質CD34陽性細胞數。

2.3.5 Western blot法檢測大鼠腦缺血半暗帶區皮質HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表達水平 每個亞組隨機取3只大鼠斷頭取腦,分離右側缺血半暗帶區腦組織。取100 mg組織加入RIPA細胞裂解液1 mL(內含1 mmol PMSF)裂解,進行電泳、轉膜、封閉等;按試劑盒步驟孵育一抗、二抗;使用ECL發光試劑盒檢測蛋白,運用X膠片曝光顯像,利用凝膠成像系統照相,采用灰度值進行統計分析。

2.3.6 RT-PCR檢測大鼠腦缺血半暗帶區皮質HIF-1α、VEGF、EPO mRNA的表達 每個亞組隨機取6只大鼠麻醉取腦。取50～100 mg腦組織剪碎,提取組織中總RNA,用逆轉錄試劑盒進行反轉錄,使RNA轉換成cDNA后進行PCR反應,反應結束后得到HIF-1α、VEGF、EPO基因CT值,以2-ΔΔCT表示目的基因的相對表達量。引物序列及產物長度見表1。

表1 目的基因RT-PCR的引物序列

3 結果

3.1 3組大鼠mNSS比較 假手術組大鼠無神經功能缺損體征,隨著時間的延長,模型組、電針組大鼠mNSS均顯著減少(P<0.05)。與假手術組比較,模型組大鼠術后4 h,3、7、14 d,mNSS均顯著增加(P<0.05)。與模型組比較,電針組大鼠術后7、14 d評分顯著減少(P<0.05)。見圖1。

注:A.術后4 h;A′.插線后5 min;B.術后3 d;C.術后7 d;D.術后14 d;與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與術后4 h比較,aP<0.05;與插線后5 min比較,a′P<0.05;與術后3 d比較,bP<0.05;與術后7 d比較,cP<0.05

3.2 3組大鼠缺血半暗帶區皮質rCBF比較 假手術組大鼠rCBF正常平穩,隨著時間的延長,模型組、電針組大鼠rCBF均顯著增加(P<0.05)。與假手術組比較,模型組大鼠插線后5 min,術后3、7、14 d rCBF均顯著減少(P<0.05)。與模型組比較,電針組大鼠術后7、14 d rCBF均顯著增加(P<0.05)。見圖1。

3.3 3組大鼠缺血半暗帶區皮質組織形態比較 假手術組大鼠術后各時點皮質神經元形態、結構正常,無水腫,無炎癥細胞浸潤。模型組、電針組術后3 d缺血半暗帶區皮質細胞結構疏松、呈網狀,排列紊亂稀疏,大量神經元壞死,間質水腫明顯,術后7、14 d神經元形態、結構、排列等情況均有所改善,且電針組改善效果更佳。見圖2。

圖2 3組大鼠缺血半暗帶區皮質組織

3.4 3組大鼠缺血半暗帶區皮質CD34陽性細胞數比較 隨著時間的延長,假手術組、模型組大鼠CD34陽性細胞數變化差異無統計學意義(P>0.05),電針組大鼠CD34陽性細胞數顯著增加(P<0.05),且整體呈上升趨勢。與假手術組比較,模型組大鼠CD34陽性細胞數顯著增加(P<0.05)。與模型組比較,電針組大鼠CD34陽性細胞數顯著增加(P<0.05)。見圖3、圖4。

注:紅色箭頭所指棕黃色顆?；驐l索狀物為CD34陽性細胞

注:與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與術后3 d比較,bP<0.05;B.術后3 d;C.術后7 d;D.術后14 d

3.5 3組大鼠缺血半暗帶區皮質HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表達水平比較 隨著時間的延長,假手術組大鼠HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表達水平變化差異均無統計學意義(P>0.05),模型組、電針組HIF-1α、VEGF蛋白表達水平術后14 d顯著升高(P<0.05),EPO蛋白表達水平術后3 d最高(P<0.05)。與假手術組比較,模型組HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,電針組HIF-1α、VEGF、EPO蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。見圖5。

注:B.術后3 d;C.術后7 d;D.術后14 d;Ⅰ.假手術組;Ⅱ.模型組;Ⅲ.電針組;與假手術組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與術后3 d比較,bP<0.05;與術后7 d比較,cP<0.05

3.6 3組大鼠缺血半暗帶區皮質HIF-1α、VEGF、EPO mRNA表達水平比較 隨著時間的延長,假手術組大鼠HIF-1α、VEGF、EPO mRNA表達水平變化差異均無統計學意義(P>0.05),模型組大鼠VEGF、EPO mRNA表達水平呈上升趨勢,均在術后14 d顯著升高(P<0.05),電針組大鼠HIF-1α、EPO mRNA表達水平呈上升趨勢,均在術后14 d顯著升高(P<0.05)。與假手術組比較,模型組HIF-1α、VEGF、EPO mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,電針組HIF-1α、VEGF、EPO mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05)。見圖6。

注:B.術后3 d;C.術后7 d;D.術后14 d;與假手術組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與術后3 d比較,bP<0.05;與術后7 d比較,cP<0.05

4 討論

血管新生可能是治療缺血性疾病的新靶點[13-14]。IS發生后,血管新生是腦血管系統重塑的重要方式,新生的血管能及早改善和恢復缺血半暗帶區的血液供應,修復瀕臨死亡的神經元、神經膠質細胞和血管內皮細胞,形成新的側支血管,為神經重塑、腦功能重組提供重要物質基礎。因此,刺激血管內皮細胞增殖、分化、遷移和微血管形成是治療腦缺血的新途徑。

電針療法將中醫學治療手段和現代電刺激治療相結合,治療腦卒中療效顯著[15]。IS可歸屬于中醫學“中風”范疇,屬本虛標實之證,以風火相煽、痰濕雍盛、氣血逆亂為標,肝腎不足、氣血衰少為本,實由虛致,病位在腦?；跀祿诰蚣夹g分析[16]和穴位配伍規律,本研究選取“百會”“水溝”“足三里”“曲池”?！鞍贂薄八疁稀毕刀矫}穴位,有益腦滋髓、開竅啟閉之效,臨床療效顯著?！爸勿舄毴￡柮鳌?“足三里”“曲池”為手陽明經和足陽明經的合穴,針刺陽明經合穴可疏通經絡,補臟腑原氣,扶機體正氣,促偏癱肢體恢復。本研究結果顯示,針刺上述穴位能有效改善大鼠神經功能缺損狀況。

HIF-1α廣泛存在于哺乳動物細胞中,是低氧狀態下調控血管新生和穩定細胞內環境和氧平衡的核心調控因子,是介導低氧信號的轉導中樞[17]。VEGF、EPO是HIF-1α下游重要的靶基因。常氧條件下,HIF-1α呈低表達,當機體缺血低氧后,HIF-1α和HIF-1β結合形成HIF-1后再次進入細胞核,HIF-1與細胞核中的低氧反應元件結合,作用于VEGF編碼基因和VEGFR編碼基因的結合位點,增加VEGF mRNA的表達,使VEGF蛋白合成增加,同時激活EPO,參與調控血管生成,保護神經元免受低氧或缺血誘導的損傷[18-19]。VEGF可能通過激活下游VEGFR-PI3K-AKT-eNOS通路,刺激血管內皮細胞增殖、分化、遷移而促血管新生;VEGF有舒張血管作用,可增加腦血流量[20]。腦組織在低氧條件下產生的EPO,對血管內皮細胞有促有絲分裂和正趨化作用,維持血管完整性,促血管生成,且生成潛力與VEGF相當[21]。VEGF和EPO之間具有相互促進、循環激活趨勢。本研究發現,腦缺血低氧環境會誘導內源性HIF-1α高表達,上調VEGF、EPO表達水平,啟動血管新生機制,發揮一定程度的防御作用,但機體自我修復能力有限,尚不足以代償原有血液供應。電針療法可進一步上調HIF-1α、VEGF、EPO表達,促進內皮細胞增殖和遷移,從而加速血管新生,提高rCBF,改善大鼠神經功能缺損狀況,且存在時間蓄積效應。

CD34可作為血管新生標志物,CD34陽性細胞數量可代表內皮祖細胞數量,用于觀察腦缺血后血管的新生情況[22]。內皮祖細胞在正常成年人外周血中含量極低,具有高度增殖性,具有啟動新血管形成和靶向修復受損血管的雙重作用[23]。本研究發現,電針療法能促進CD34陽性細胞數量增加,可能對缺血損傷區域內皮細胞和神經元生長恢復發揮保護作用,為神經血管單元提供良好的微環境。

綜上所述,電針“百會”“水溝”“足三里”“曲池”能激活HIF-1α-VEGF-EPO通路蛋白和基因表達,增加CD34陽性細胞數量,介導內皮細胞血管新生,從而提高MCAO大鼠rCBF,改善腦組織結構和功能,且治療效果具有時間累積效應。隨著低氧環境的改善、腦血流的恢復,電針療法為何能使HIF-1α持續增高?是否腦缺血后HIF的誘導不完全是低氧本身的結果?是否有其他通路調控HIF-1α的表達?這些將是下一步研究的方向。