肝豆補腎湯通過抑制鐵死亡和內質網應激改善肝豆狀核變性模型TX小鼠卵巢組織損傷

劉千琢,韓 輝,房新如,王路遙,趙 丹,吳麗敏

(1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院,安徽 合肥 230031;2.中國科學技術大學附屬第一醫院生殖中心,安徽 合肥 230001)

肝豆狀核變性(hepatolenticular degeneration,HLD)是一種由ATP7B基因突變引起的常染色體隱性遺傳性疾病[1]?；颊咩~代謝障礙,過量的銅沉積在機體,常表現為肝、腦等全身多器官損害[2]。近年來,HLD合并生殖系統損害的報道逐漸增多,女性HLD患者常伴有月經不調、閉經及自然流產等表現[3]。因此,對HLD生殖功能損害的關注是十分必要的。

鐵死亡是一種鐵依賴性調節性細胞死亡,由大量脂質過氧化物介導的膜損傷引起。鐵死亡與多囊卵巢綜合征、卵巢功能不全和自然流產等多種女性生殖障礙相關[4]。最近研究[5]發現,鐵死亡常參與銅誘導的精子發生障礙。鐵死亡涉及HLD[6-7],而HLD患者體內也存在鐵過載[8]及氧化和(或)抗氧化失衡等[9],因此,調控鐵死亡可能是緩解和治療HLD的有效手段。內質網(endoplasmic reticulum,ER)應激是一種保護性應激反應,但持續的ER應激也會導致細胞死亡[10]。研究[11]發現,過度的ER應激會對卵子的生成產生負面影響,并誘導多種生殖系統疾病的發生。此外,ER應激與鐵死亡的發生密切相關[12]。同時,研究[13]發現,銅誘導的毒性作用與ER應激密切相關。然而,鐵死亡和ER應激是否參與HLD患者銅暴露引起的卵巢損害目前尚不清楚。

青霉胺等銅螯合劑仍然是目前治療HLD的主要藥物[14],但其常伴有過敏和免疫損傷等不良反應。傳統中藥具有全面調節身體功能、不良反應小等優點。肝豆補腎湯是基于HLD痰瘀互結病機和“腎主生殖”理論研制而成的中藥方劑。臨床研究[15]結果表明,該方有助于HLD月經不調患者優勢卵泡發育,刺激雌二醇和孕酮分泌,改善HLD患者的月經紊亂情況。本實驗以TX小鼠作為HLD模型,觀察肝豆補腎湯對TX小鼠卵巢損害的保護作用,探究TX小鼠銅代謝障礙引起卵巢損害的可能機制。

1 材料

1.1 動物 30只C3He-ATP7btx-j小鼠采購于美國Jackson實驗動物中心,編號 40886617,10只正常對照組小鼠采用DL同系對照小鼠。實驗動物使用許可證號:SYXK(皖)2022-005。所有研究方案均經過安徽中醫藥大學動物實驗倫理委員會審查(批準號:2014030311)。小鼠在每天光照12 h和黑暗12 h的環境下飼養,動物房溫度18～20 ℃,濕度50%～60%,自由采食、飲水。

1.2 藥物 肝豆補腎湯(丹參20 g,黃連、莪術、姜黃、雞血藤、杜仲、枸杞子、熟地黃、益母草、當歸各10 g,菟絲子、大黃、淫羊藿各6 g,均為顆粒劑,由廣東一方制藥有限公司提供)購于安徽中醫藥大學第一附屬醫院,臨用時配置成1.3 g/mL的藥液。青霉胺片(上海上藥信誼藥廠有限公司,國藥準字 H31022286)。

1.3 主要試劑 前列腺素過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)抗體(批號 GR3210900-1):美國Abcam公司;谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)抗體(批號 AB10101745)、葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)抗體(批號 AD19205601)、磷酸化蛋白激酶核糖核酸樣內質網激酶(phosphorylated protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase,p-PERK)抗體(批號 9)、磷酸化真核起始因子2α(phosphorylated eukaryotic initiation factor 2 alpha-subunit,p-eIF2α)抗體(批號 AG19260018)、活化轉錄因子4(activating transcription factor 4,ATF4)抗體(批號 AH19026512):北京Bioss公司;PERK抗體(批號 11)、eIF2α抗體(批號 7):美國CST公司;C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP;批號 CJ36131):南京巴傲得生物科技有限公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH;批號 200040908):北京Zsbio公司;血清鐵測定試劑盒(批號 A039-1-1)、脂質過氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒(批號 A003-1)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)及氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)測定試劑盒(批號 A061-1):南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 分組及給藥 將30只TX小鼠隨機分為HLD組、青霉胺組和肝豆補腎湯組,每組10只。肝豆補腎湯組按1.5 g/(kg·d)灌胃給藥,青霉胺組按0.1 g/(kg·d)灌胃給藥,HLD組和正常對照組給予等容量生理鹽水灌胃。小鼠用藥量均相當于成人臨床用藥量的9倍。各組小鼠均于每日上午9:00灌胃,每日1次,共28 d。

2.2 標本采集與處理 末次給藥后第2日上午9:00—10:00,各組小鼠均給予10 IU孕馬血清促性腺激素,24 h后,每組取4只小鼠注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉。取左側卵巢置于甲醛中,用于蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,將右側卵巢置于戊二醛溶液中以備用于透射電子顯微鏡觀察。注射孕馬血清促性腺激素48 h后,予每組其余6只小鼠腹腔注射10 IU人絨毛膜促性腺激素。間隔14 h后,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,從眼部取血,離心,取血清,置于-80 ℃冰箱中。隨后,脫頸法處死小鼠,取出雙側卵巢,采用1 mL針頭將小鼠輸卵管壺腹刺破,使卵泡排入體外培養液,在顯微鏡下計數,并將卵巢組織保存于-80 ℃冰箱。

2.3 卵巢系數評估 所有小鼠在麻醉前稱質量,麻醉后立即取出雙側卵巢,經生理鹽水沖洗、濾紙吸干后稱質量,計算卵巢系數。小鼠卵巢系數=雙側卵巢質量/小鼠體質量×100%。

2.4 光學顯微鏡下觀察卵巢組織形態 剝離小鼠卵巢組織,在多聚甲醛溶液中固定36 h,石蠟包埋,連續切片。HE染色后,光學顯微鏡下觀察卵巢組織結構及小鼠卵泡生長情況,并對各級卵泡進行計數。

2.5 透射電子顯微鏡下觀察卵巢組織的超微結構 取1 mm3卵巢組織塊,經戊二醛固定、梯度脫水、石蠟包埋,再于烘箱內固化,然后進行超薄切片。在透射電子顯微鏡下觀察卵巢組織的超微結構。

2.6 血清鐵含量及卵巢組織中GSH、GSSG、MDA含量測定 采用比色法測定血清中鐵含量,采用硫代巴比妥酸法檢測卵巢組織中MDA含量,采用微量酶標法檢測卵巢組織中GSH及GSSG水平。

2.7 Western blot法測定卵巢組織中PTGS2、GPX4、GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達水平 用RIPA細胞裂解緩沖液裂解卵巢組織,勻漿后提取總蛋白。根據TRAKRA產品目錄配置凝膠。將5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液以1∶4的比例添加至所收集的蛋白樣品中,在沸水浴中使蛋白質完全變性,再將蛋白質樣品加入SDS-PAGE膠中,在80 V電壓下電泳,蛋白分離后采用200 mA電流轉至PVDF膜上,5%脫脂奶粉密封后,在室溫下放置2 h。根據制造商提供的參考濃度將PVDF膜與特異性一抗在4 ℃下孵育過夜。洗滌后,將蛋白膜與偶聯有HRP的二抗在室溫下孵育1.2 h。最后,使用ECL plus蛋白質印跡檢測系統檢測蛋白質,使用Image J軟件(版本號 v1.8.0,美國國立衛生研究院)分析蛋白質水平。

3 結果

3.1 4組小鼠體質量、卵巢質量、卵巢系數比較 與正常對照組比較,HLD組小鼠卵巢質量顯著降低(P<0.05);與HLD組比較,肝豆補腎湯組和青霉胺組小鼠體質量、卵巢質量、卵巢系數均有升高趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表1。

表1 4組小鼠體質量、卵巢質量及卵巢系數比較

注:A.正常對照組;B.HLD組;C.青霉胺組;D.肝豆補腎湯組

3.2 4組小鼠促排卵后排卵數比較 與正常對照組比較,HLD組小鼠排卵數顯著降低(P<0.05);與HLD組比較,青霉胺組和肝豆補腎湯組小鼠排卵數顯著增加(P<0.05);肝豆補腎湯組與青霉胺組排卵數比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組小鼠促排卵后排卵數比較

3.3 4組小鼠卵巢組織形態比較 正常對照組小鼠各級卵泡發育正常,其中卵母細胞呈圓形,顆粒細胞在周圍包繞,排列整齊;HLD組小鼠卵母細胞核固縮,細胞質溶解,透明帶塌陷、斷裂,顆粒細胞層減少,閉鎖卵泡增加;青霉胺組小鼠次級卵泡和竇狀卵泡形態明顯改善;肝豆補腎湯組小鼠次級卵泡和竇狀卵泡發育正常,顆粒細胞排列緊密,卵泡形態與正常對照組接近。見圖2。

注:A.正常對照組;B.HLD組;C.青霉胺組;D.肝豆補腎湯組;E、F、G、H分別為A、B、C、D方框內放大部分

3.4 4組小鼠卵巢超微結構比較 HLD組小鼠卵巢出現線粒體明顯皺縮、嵴斷裂和嵴減少等典型鐵死亡表現,并出現ER腫脹、部分脫顆粒等ER應激現象;與HLD組比較,肝豆補腎湯組和青霉胺組小鼠卵巢線粒體鐵死亡表現和ER應激現象顯著改善,形態接近正常對照組。見圖3。

注:A.正常對照組;B.HLD組;C.HLD組;D.青霉胺組;E.肝豆補腎湯組;F、G、H、I、J分別為A、B、C、D、E方框內放大部分;A、B、C、D、E中標尺示2 μm,F、G、H、I、J中標尺示500 nm;紅色箭頭指向異常線粒體,藍色箭頭指向異常ER

3.5 4組小鼠血清鐵及卵巢組織中MDA、GSH、GSSG表達水平比較 與正常對照組比較,HLD組小鼠血清鐵及卵巢組織中MDA、GSSG水平顯著升高(P<0.05),卵巢組織中GSH水平和GSH/GSSG顯著降低(P<0.05);與HLD組比較,青霉胺組、肝豆補腎湯組小鼠血清鐵及卵巢組織中MDA、GSSG水平顯著降低(P<0.05),卵巢組織中GSH水平和GSH/GSSG顯著升高(P<0.05)。肝豆補腎湯組與青霉胺組上述指標比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

注:A.正常對照組;B.HLD組;C.青霉胺組;D.肝豆補腎湯組;與正常對照組比較,*P<0.05;與HLD組比較,#P<0.05

3.6 4組小鼠卵巢組織PTGS2、GPX4蛋白表達水平比較 與正常對照組比較,HLD組小鼠卵巢組織PTGS2表達水平顯著升高(P<0.05),GPX4表達水平顯著降低(P<0.05);與HLD組比較,青霉胺組和肝豆補腎湯組PTGS2表達水平顯著降低(P<0.05),GPX4表達水平顯著升高(P<0.05)。與青霉胺組比較,肝豆補腎湯組PTGS2表達水平顯著降低(P<0.05),GPX4表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖5。

注:A.正常對照組;B.HLD組;C.肝豆補腎湯組;D.青霉胺組;與正常對照組比較,*P<0.05;與HLD組比較,#P<0.05;與肝豆補腎湯組比較,△P<0.05

3.7 4組小鼠卵巢組織GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達水平比較 與正常對照組比較,HLD組小鼠卵巢組織GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與HLD組比較,青霉胺組卵巢組織GRP78、p-PERK、p-eIF2α表達水平顯著降低(P<0.05),肝豆補腎湯組GRP78、p-PERK、p-eIF2α、CHOP表達水平均顯著降低(P<0.05)。見圖6。

4 討論

HLD是由于基因突變導致P型ATP7B酶功能或含量異常,使銅無法與銅藍蛋白前體蛋白結合形成銅藍蛋白,導致游離銅增多、銅代謝紊亂,進而造成肝、腦等全身多器官損傷的代謝性疾病。越來越多的研究報道了銅暴露對生殖功能的損害[16]。女性生殖功能異常在HLD患者中很常見。

肝豆補腎湯由大黃、黃連、莪術、姜黃、丹參、雞血藤、杜仲、枸杞子、熟地黃、菟絲子、淫羊藿、益母草和當歸組成,是臨床治療HLD合并生殖功能異常常用的經驗方,療效較好[15,17]。課題組前期研究[18]發現,肝豆補腎湯可以提高銅負荷小鼠的排卵數,促進卵泡發育,改善線粒體結構,提升卵丘復合物顆粒細胞的增殖能力。同時,現代研究證實,杜仲、菟絲子、熟地黃、淫羊藿及枸杞子可以調節人體下丘腦—垂體—性腺軸的功能,促進促卵泡激素及促黃體生成素的分泌,改善卵巢及子宮血液供應,從而促進卵泡發育。在本實驗中,經肝豆補腎湯干預后,卵巢組織結構破壞減輕,閉鎖卵泡數量減少,排卵率有所提高,這提示肝豆補腎湯對TX小鼠卵巢組織具有保護作用。

鐵死亡是近期發現的一種細胞死亡方式,是鐵依賴性脂質過氧化反應[19]。最近研究[5]表明,銅可以通過誘導鐵死亡的發生而起到不利作用。PTGS2是鐵死亡的重要生物標志物。GSH是細胞中重要的抗氧化劑,在掃除脂質自由基中起關鍵作用。鐵死亡誘導劑erastin可以通過抑制SLC7A11阻礙GSH的合成[20]。同時,GSH還是GPX4發揮作用的關鍵因子。GPX4是一種硒蛋白,其通過抑制脂質過氧化、清除脂質過氧化物維持細胞內氧化還原穩態[21],GPX4下調通常是鐵死亡發生的關鍵因素。此外,鐵沉積、脂質過氧化是鐵死亡的重要特征[22-23]。鐵死亡是鐵依賴性的細胞死亡方式,鐵含量是鐵死亡發生的重要條件。脂質過氧化屬于生物體氧化還原系統的失衡,在鐵死亡發生過程中起到主要的驅動作用,可以通過破壞細胞膜的磷脂雙分子層結構及脂質過氧化產物MDA等的細胞毒性作用誘發鐵死亡[24]。本研究中,HLD組小鼠卵巢組織中PTGS2表達水平顯著增加,GPX4表達水平顯著降低,血清鐵及卵巢組織中MDA、GSSG表達水平明顯增加,而卵巢組織中GSH表達水平顯著降低。經肝豆補腎湯和青霉胺干預后PTGS2表達水平降低,GPX4表達水平升高,血清鐵及卵巢組織中MDA、GSSG水平顯著降低,卵巢組織中GSH消耗顯著減少。結果表明,TX小鼠體內銅代謝障礙可誘導其卵巢組織鐵死亡的發生,而肝豆補腎湯可以減少小鼠鐵含量,改善脂質過氧化物產物堆積,恢復抗氧化系統功能,從而抑制卵巢組織的鐵死亡。

機體在應激狀態下會發生ER應激,這是一種保護性反應,但應激持續產生或程度加劇也會引起細胞死亡。ER應激與鐵死亡聯系密切,在各種因素誘導的鐵死亡過程中,ER應激也增加[25]。Xu等[26]發現,ER應激是導致潰瘍性結腸炎結腸上皮細胞鐵死亡的誘發因素。PERK介導的ER應激與鐵死亡關系密切。而銅造成的細胞毒性也與該通路介導的ER應激有關[27]。研究[28]表明,機體在受到刺激等異常情況下,PERK會與GRP78分開,發生自磷酸化,并進一步活化下游轉錄因子,包括eIF2α、ATF4和CHOP。本研究結果顯示,TX小鼠卵巢組織中PERK介導的ER應激通路上相關蛋白表達水平均升高,且電子顯微鏡下可見TX小鼠卵巢細胞ER腫脹、脫顆粒等ER應激表現。而青霉胺和肝豆補腎湯干預后,PERK介導的ER應激通路上相關蛋白表達水平均降低。結果表明,銅暴露能誘導ER應激的發生,肝豆補腎湯能抑制銅誘導的ER應激。

綜上所述,TX小鼠銅代謝障礙可以誘導卵巢組織損傷,其機制可能與銅沉積誘導鐵死亡與ER應激有關,而肝豆補腎湯可以通過抑制鐵死亡和PERK通路介導的ER應激發揮保護作用。本研究顯示,肝豆補腎湯改善某些指標的作用優于青霉胺,這可能是因為肝豆補腎湯中多種藥效成分通過多途徑、多靶點協同作用于機體,其療效優于僅具有排銅作用的青霉胺。今后可應用相關抑制劑對卵巢組織細胞進行體外實驗,以深入探索鐵死亡與ER應激之間的聯系。