癡呆健腦方調控NEK7/NLRP3炎癥小體通路防治血管性癡呆

李偉峰,秦合偉,姬令山,董新剛

(1.河南中醫藥大學,河南 鄭州 450002;2.河南中醫藥大學第二附屬醫院,河南 鄭州 450002;3.河南中醫藥大學第一附屬醫院,河南 鄭州 450008)

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是由一系列腦血管疾病所引發的認知障礙綜合征,是第二大癡呆類型[1-2],多呈波動性臨床癥狀和階梯式病情進展,目前尚無公認有效的治療方法[3]。本病發病機制尚不十分明確,但關于炎癥因子參與疾病進程、炎癥反應誘發病理改變是VD主要發病機制之一的認識已被學者廣泛認可[4]?；谌珖现嗅t藥專家經驗,本課題組前期已開展了益腎祛痰活血法治療VD的評價研究[5]和小樣本臨床驗證[6]。本研究主要從炎癥反應、細胞凋亡角度出發,觀察癡呆健腦方對VD模型大鼠凋亡相關蛋白及炎癥因子表達的影響,以明晰癡呆健腦方的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SD雄性大鼠200只,體質量(250±20)g,購自鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場[動物生產許可證號:SCXK(豫)2020-0010]。所有動物飼養于河南省中醫院動物實驗中心[動物使用許可證號:SYXK(豫)2016-0009],于(22±1)℃恒溫、60%～75%恒濕、12 h循環照明的環境下飼養,自由攝食、飲水。本實驗設計方案經河南省中醫院動物實驗倫理委員會審核通過,倫理審核編號:20190712。

1.2 藥物 癡呆健腦方組成:熟地黃20 g,黨參、白術各15 g,山茱萸、遠志、茯苓、桃仁、川芎、石菖蒲、生姜各10 g,肉桂8 g。方中所有中藥飲片均來源于河南省中醫院藥劑科。鹽酸多奈哌齊片(國藥準字 H20070181)由衛材(中國)藥業有限公司生產。

1.3 試劑 熒光定量PCR試劑盒(批號 A8203-6):TaKaRa公司;蛋白提取試劑盒(批號 P0027):碧云天公司;NIMA相關激酶7(NIMA-related kinase 7,NEK7)抗體(批號 ab8178)、Nod樣受體家族含pyrin結構域蛋白3 (Nod-like receptor family, pyrin domain-containing protein 3,NLRP3)抗體(批號 ab8066)、含CARD結構域的凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)抗體(批號 ab8011)、半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶 (cysteinyl aspartate specific proteinase-1, Caspase-1)抗體(批號 ab8191)、消皮素D (gasdermin D,GSDMD)抗體(批號 ab8011)、白細胞介素(interleukin, IL)-1β ELISA試劑盒(批號 ab4605)、IL-6 ELISA試劑盒(批號 ab178013)、IL-18 ELISA試劑盒(批號 ab215539)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒(批號 ab181421):英國Abcam公司;2.5%戊二醛溶液(批號 H44021172):廣東恒健制藥有限公司。

2 方法

2.1 動物模型復制 采用改良雙側頸總動脈分次結扎法[7]復制大鼠VD模型。大鼠術前禁食禁水12 h,稱質量,在保持18～29 ℃的室溫條件下,通過腹腔注射4%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉,麻醉后將大鼠仰臥固定于手術臺上,對術區進行無菌操作后,將大鼠固定,暴露頸部,取頸正中切口切開1.5～2 cm,暴露右側頸總動脈和迷走神經,分離迷走神經和頸總動脈,以1號手術線將右側頸總動脈永久性結扎致腦缺血,縫合傷口,3 d后拆除頸部手術線。以相同的方法結扎大鼠左側頸總動脈并縫合。術后,每只大鼠腹腔注射2 U慶大霉素,每日1次,連續5 d。假手術組大鼠進行做麻醉和頸總動脈分離,不結扎。術后將大鼠置于干凈鼠籠中,保溫,適應性喂養1周后,進行Morris水迷宮訓練5 d,篩選VD大鼠。模型復制7 d后,采用Morris水迷宮試驗篩選VD大鼠,以首次跨越平臺時間(逃避潛伏期)明顯延長、跨越平臺次數明顯少于正常大鼠作為模型復制成功的標準。

2.2 分組及干預 選取模型復制成功的100只大鼠,按照隨機數字表法分為5組,各組大鼠分別給予相應干預方法,每日1次,連續干預1個月。①假手術組:手術后不結扎頸總動脈,不進行藥物干預;②模型組:給予生理鹽水灌胃;③多奈哌齊組:給予鹽酸多奈哌齊每日3 mg/kg(相當于60 kg成人臨床用量的6.3倍)灌胃;④癡呆健腦方高劑量組:給予癡呆健腦方每日32 g/kg(相當于60 kg成人臨床用量的23.3倍)灌胃;⑤癡呆健腦方中劑量組:給予癡呆健腦方每日16 g/kg灌胃。

2.3 觀察指標

2.3.1 空間學習記憶能力檢測 干預1個月后采用Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶能力,主要內容包括定位航行試驗及空間探索試驗。

2.3.2 大鼠海馬神經元形態學觀察 將大鼠腦組織置于10%中性甲醛中,在4 ℃下靜置24 h。用乙醇梯度洗脫,二甲苯透明,石蠟包埋,切取4 μm冠狀切片,制作石蠟切片。采用蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,光學顯微鏡下觀察大鼠海馬區神經元形態。

2.3.3 TUNEL法檢測大鼠海馬神經元凋亡指數 大鼠禁食12 h,稱質量,麻醉后斷頭處死,冰上迅速開顱取出全腦,分離海馬,多聚甲醛浸泡固定24 h,先后依次進行組織脫水、組織透明、浸蠟、包埋、切片、撈片、烤片、脫蠟、漂洗、孵育、洗滌、復染核,用含有抗熒光淬滅劑的封片液封片,熒光顯微鏡下觀察大鼠海馬神經元凋亡情況。

2.3.4 透射電子顯微鏡觀察大鼠海馬神經元形態 采用醋酸雙氧鈾/枸櫞酸鉛雙染色法染色后,在JEM-1011透射電子顯微鏡下進行觀察,使用Soft Imaging Solutions Gmb H病理影像系統采集圖像,圖像放大倍數為20 000倍,每只大鼠隨機拍攝5張圖像。觀察大鼠海馬神經元形態。

2.3.5 Real-time PCR法檢測大鼠海馬NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD mRNA表達水平 取大鼠海馬組織標本100 mg,提取總RNA,測定總RNA的濃度和純度,電泳,逆轉錄,將熒光染料SYBR Green與目的基因和內參GADPH的引物混勻后,上機檢測。反應參數:95 ℃ 30 s,1個循環;95 ℃ 5 s,55 ℃ 10 s,40個循環。采用2ΔΔCT法計算目的基因的表達水平,以GAPDH為內參。

2.3.6 Western blot法檢測大鼠海馬NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平 取大鼠海馬組織,用試劑盒提取蛋白后,采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度;采用6%～15% SDS聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳,蛋白分離后采用恒定電流200 mA轉膜至PVDF膜上;室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h,用相應的一抗,按照1∶1 000稀釋,4 ℃孵育過夜;洗滌后換HRP標記二抗,按照1∶5 000稀釋,室溫孵育2 h,TBST洗滌3次,洗滌后顯影;使用Image J(版本號:v1.8.0;版權所有者:美國國立衛生研究院)分析條帶灰度值,測定目的條帶和內參β-actin的灰度值,結果以樣本灰度值與內參灰度值的比值表示。

2.3.7 ELISA法檢測各組大鼠海馬IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平 嚴格按照ELISA試劑盒說明書測定IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平。

3 結果

3.1 5組大鼠空間學習記憶能力比較 與假手術組比較,模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05),穿越平臺次數明顯減少(P<0.05),目標象限時間比明顯降低(P<0.05);與模型組比較,多奈哌齊組,癡呆健腦方高、中劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05),穿越平臺次數明顯增加(P<0.05),目標象限時間比明顯升高(P<0.05);癡呆健腦方高劑量組和中劑量組各項指標比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠空間學習記憶能力比較

3.2 5組大鼠海馬神經元形態比較 假手術組大鼠海馬神經元整體形態規整,分布均勻,神經元之間緊密,結構完整,排列整齊,層次明顯,神經元型圓,核仁形態大小正常且清晰,神經元無明顯缺失。模型組大鼠海馬神經元整體形態不規則,神經元間隙大小不一,排列紊亂、不緊密,多數神經元結構不完整,層次較差,神經元細胞核固縮、碎裂、溶解,核仁消失,胞質減少,可見大量壞死的神經元,神經元缺失明顯。多奈哌齊組大鼠海馬神經元整體形態較模型組規整,神經元連接相對緊密,間隙相對均勻,神經元結構較明顯,排列整齊,可見相對清楚的神經元細胞核,個別神經元細胞核固縮、碎裂,壞死的神經元較少。癡呆健腦方高劑量組和中劑量組大鼠海馬大部分神經元分布均勻,形態規整,神經元間隙均勻,神經元型圓,神經元結構明顯,層次清楚,核仁形態大小正常,神經元細胞核固縮、碎裂極少,壞死的神經元極少。

注:A.假手術組;B.模型組;C.多奈哌齊組;D.癡呆健腦方高劑量組;E.癡呆健腦方中劑量組

3.3 5組大鼠海馬神經元凋亡率比較 假手術組大鼠海馬組織內僅可見個別棕褐色的凋亡神經元,而模型組可見大量核染色的凋亡神經元,模型組神經元凋亡率明顯高于假手術組(P<0.05);多奈哌齊組大鼠海馬神經元凋亡率明顯低于模型組(P<0.05);癡呆健腦方高劑量組大鼠海馬內可見部分核呈棕褐色的凋亡神經元,癡呆健腦方高、中劑量組神經元凋亡率明顯低于模型組(P<0.05);癡呆健腦方高、中劑量組神經元凋亡率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2、圖2。

注:A.假手術組;B.模型組;C.多奈哌齊組;D.癡呆健腦方高劑量組;E.癡呆健腦方中劑量組;箭頭示凋亡神經元

表2 5組大鼠神經元凋亡率比較

3.4 5組大鼠海馬超微結構比較 假手術組大鼠海馬神經元形態正常,核膜結構完整,細胞核染色均勻,核仁形態正常,細胞器結構正常,線粒體呈橢圓形,神經纖維排列整齊。模型組大鼠海馬神經元呈現不同程度的變性壞死,形狀不規則,神經元體積縮小,核固縮,核仁消失,細胞質減少,細胞器形態改變,線粒體和內質網腫脹。神經纖維排列走行紊亂,形態不規則。多奈哌齊組大鼠海馬變性或壞死的神經元數量較少,線粒體結構相對完整,神經纖維排列走行相對清晰。癡呆健腦方高、中劑量組大鼠海馬超微結構和神經元形態結構基本正常,變性或壞死的神經元極少,細胞器形態大致正常,線粒體形態結構基本完整,神經纖維排列走行整齊清晰。見圖3。

3.5 5組大鼠海馬NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD mRNA表達水平比較 與假手術組比較,模型組大鼠海馬NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD mRNA表達水平均明顯升高(P<0.05);與模型組比較,多奈哌齊組,癡呆健腦方高、中劑量組大鼠海馬NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD mRNA表達水平均明顯降低(P<0.05);癡呆健腦方高、中劑量組上述5種mRNA水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 5組大鼠海馬NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD mRNA表達水平比較

3.6 5組大鼠海馬NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平比較 與假手術組比較,模型組大鼠海馬NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05);與模型組比較,多奈哌齊組,癡呆健腦方高、中劑量組大鼠海馬NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05);癡呆健腦方高、中劑量組上述5種蛋白表達水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖4。

注:A.假手術組;B.模型組;C.多奈哌齊組;D.癡呆健腦方高劑量組;E.癡呆健腦方中劑量組

注:A.假手術組;B.模型組;C.多奈哌齊組;D.癡呆健腦方高劑量組;E.癡呆健腦方中劑量組

表4 5組大鼠海馬NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD蛋白表達水平比較

3.7 5組大鼠海馬IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平比較 與假手術組比較,模型組大鼠海馬IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,多奈哌齊組,癡呆健腦方高、中劑量組大鼠海馬IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平均明顯降低(P<0.05);癡呆健腦方高、中劑量組上述4種炎癥因子水平比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 5組大鼠海馬IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平比較

4 討論

VD屬中醫學“呆病”范疇,為本虛標實之證,痰濁、瘀血痹阻腦絡,日久致腎精虧虛是本病的基本病機。如《辨證奇聞·呆》曰:“痰不化,胃衰則土不制水,痰不消,于是痰積胸中,盤踞心外,使神明不清,呆成?！薄夺t林改錯·腦髓說》曰:“高年無記性者,腦髓漸空?！?/p>

神經炎癥是VD發病機制的重要組成部分[10]。過度炎癥反應可導致神經元、神經膠質細胞死亡,觸發炎癥級聯反應,加劇VD的發展;抑制炎癥反應有助于神經元存活,改善本病的臨床癥狀與預后[11]。一方面,腦缺血神經損傷后,激活炎癥反應導致腦血管痙攣、加重腦組織缺血低氧和損傷[12];另一方面,炎癥反應產生的抑炎細胞因子通過抑制炎癥因子合成和相關受體表達,清除細胞碎片,重塑腦組織,進而提升認知功能,改善VD癥狀[13]。有研究[14-15]證實,通過抑制VD大鼠海馬小膠質細胞活化,降低IL-1β、IL-18、TNF-α等因子釋放,可減輕海馬神經元損害,改善學習記憶能力。

NLRP3炎癥小體作為神經炎癥反應的重要介質,介導了神經元損傷和神經炎癥反應[16],細胞內K+濃度的降低是NLRP3炎癥小體激活的常見通路;作為K+的特定傳感器,NEK7是NLRP3炎癥小體激活過程中的重要調節物質,與NLRP3炎癥小體相互作用,從而激活NLRP3炎癥小體[17]。細胞焦亡是一種不同于凋亡和壞死的新型程序性細胞死亡方式,以細胞不斷脹大直至膜破裂為主要表現,激活強烈的炎癥反應[18]。NOD樣受體蛋白形成炎癥小體通路是細胞焦亡的重要通路,通過激活Caspase-1促使細胞焦亡從經典途徑發生,誘導下游炎癥細胞因子(IL-1β、IL-18等)的分泌、成熟與釋放,以及GSDMD孔的形成[19-20],進而導致VD的發生和加劇,因此,NEK7/NLRP3炎癥小體通路參與了VD的進程。

癡呆健腦方由薯蕷丸、通竅活血湯化裁而來,方中熟地黃、山茱萸、肉桂益腎填髓,石菖蒲、遠志、茯苓化痰開竅,桃仁、川芎活血通經,黨參、白術、生姜益氣溫中,諸藥合用,共奏化痰通經、益腎填精之功[21]。多奈哌齊為目前治療輕、中度VD的一線常用藥物[22-24],但其臨床療效有待于進一步評價[25]。本研究結果表明,癡呆健腦方能有效改善VD大鼠空間學習記憶能力,抑制大鼠海馬神經元凋亡,癡呆健腦方組雖可見部分核染色凋亡神經元,但神經元凋亡率明顯低于模型組。癡呆健腦方組大鼠海馬神經元形態結構相似,神經元核固縮、碎裂及壞死神經元極少;與模型組比較,神經元整體形態規則,間隙均勻致密,結構層次分明。癡呆健腦方組海馬NEK7、NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD mRNA和蛋白表達水平較模型組降低,IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平較模型組降低。癡呆健腦方對VD大鼠模型干預作用無劑量依賴性。

綜上,癡呆健腦方可改善VD大鼠海馬的微環境,從而提高認知、記憶功能,這一作用可能是通過靶向調節NEK7/NLRP3炎癥小體通路相關蛋白表達水平,減少神經元凋亡后下游相關炎癥因子表達,抑制炎癥反應而實現的。