綠藻產氫的機制及研究進展

王婧怡 , 趙 琪, 賈蒲連, 付愛根, 王 菲

(1. 西北大學生命科學學院, 西安 710069; 2. 西北大學榆林碳中和學院, 西安 710069)

隨著全球人口增長和經濟飛速發展,人類對資源的需求也日益增長。煤炭等化石燃料的大量使用導致溫室氣體濃度增加,引發全球氣候變暖以及極端天氣頻發等環境問題。因此,開發可持續、無污染的新能源成為全球科學家重點研究的方向。

氫氣具有高效、清潔和熱值高等優點,被認為是最有價值的可再生能源。傳統的制氫方式包括化石燃料的重新轉化和電解水等,但這些方法并不能從根本上解決能源短缺和環境污染等問題。綠色生物制氫作為當今新能源領域的熱門方式亟待發展,有助于早日實現“碳達峰、碳中和”的目標。

生物制氫是通過多種微生物(如微藻、光合細菌和一些異養細菌等)的不同代謝途徑產生氫氣。微藻繁殖速度快且易培養,并具有固定二氧化碳的能力,其通過太陽能利用水生產氫氣,成本低且資源廣泛,是綠色工廠生產氫能源的首選物種。光合產氫的微藻主要分為真核綠藻和原核藍藻兩大類,它們以太陽光為能量來源,以水為電子供體,通過體內氫化酶的催化作用產生氫氣和其他生物燃料,并且光合產氫過程不會產生溫室氣體和其他有害物質,是目前最理想的生物制氫途徑。相比藍藻,綠藻光合產氫效率更高,目前多以綠藻作為生物產氫的研究和應用對象[1]。

1 綠藻光合產氫的作用機制

綠藻的光合作用發生在葉綠體的類囊體膜上,其光合系統包括光系統I(PSI)和光系統II(PSII),PSII利用太陽能裂解水產生氧氣和電子,而PSI利用太陽能和電子生成還原型輔酶II(NADPH)。Gaffron等[2]首次報道斜生柵藻可以產生氫氣,隨后萊茵衣藻的產氫能力也得到了證實,并成為光合產氫模式藻種[3]。目前已知的綠藻產氫途徑有3種:依賴于PSII的直接產氫、不依賴于PSII的間接產氫和暗反應發酵途徑(圖1)。前兩種產氫途徑通過綠藻光合電子傳遞鏈調節,后者主要與發酵代謝有關。

圖1 綠藻產氫的3種途徑(根據文獻[4]修改繪制)Figure 1 The hydrogen production pathways of green algae(Modified from [4])

1.1 依賴PSII的直接產氫通路

綠藻利用類囊體膜表面的捕光色素吸收太陽光,PSII的反應中心將水分解為質子和O2,并釋放電子,隨后電子進入光合電子傳遞鏈,經過質體醌(PQ)、細胞色素b6f復合體(Cytb6f)、質體藍素(PC)和PSI,再傳遞給鐵氧還原蛋白(Fd),還原的Fd將電子分配給NADPH鐵氧還蛋白還原酶FNR(主要電子受體)或氫化酶(次級電子受體),氫化酶接受Fd傳遞的電子后,使質子還原為氫氣。在厭氧條件或捕光色素吸收過多能量時,綠藻會利用氫化酶消耗多余的電子,從而避免光抑制并保護光合電子傳遞鏈[5]。直接產氫途徑的優勢在于利用水作為原料,陽光作為驅動能源,缺點是光合作用同時也會產生氧氣,從而抑制氫化酶的活性,使產氫時間較短。

1.2 不依賴PSII的間接產氫通路

不依賴PSII的間接產氫途徑一般包括兩個階段:(1)在光合作用期間積累碳水化合物,光合作用產生的還原力先被儲存在淀粉中;(2)在淀粉分解代謝的過程中產生氫氣。首先,綠藻光合作用生成的ATP和NADPH進入卡爾文循環,被用于二氧化碳的固定進而生成淀粉[6],接著在厭氧條件下,淀粉分解產生的NADH在II型NADH脫氫酶的催化作用下被氧化,同時釋放的電子通過PQ進入光合電子傳遞鏈,最后傳遞給氫化酶,產生氫氣[7]。不依賴PSII的間接產氫通路將光合裂解水階段與光合產氫階段分隔開,能夠有效防止氧氣對氫化酶活性的影響。但與直接產氫途徑相比,間接產氫通路的產氫量較低,且受到恒定光源和ATP需求的限制而無法應用到大規模生產中。

Melis等[8]在此基礎上發展了“兩步法”誘導產氫,先將萊茵衣藻在以乙酸鹽為碳源的光合異養培養基(TAP培養基)中培養至對數生長期,隨后將其轉移至缺硫的培養環境中,硫元素的缺乏使衣藻細胞內PSII核心亞基D1蛋白合成減少,光合速率降低,但呼吸作用不受影響,最終在細胞內形成厭氧環境,解除了氧氣對氫化酶活性的抑制作用,持續催化氫氣產生[9]。

1.3 暗發酵產氫

除了上述兩種情況,微藻還能夠在黑暗條件下通過分解有機物產生氫氣,這一途徑稱為暗發酵產氫。該途徑無需光能和水,且能夠持續產氫6 h以上,但產氫量遠遠低于光合產氫量[10],因為在暗發酵過程中復雜的有機物需要經過水解、酸化、乙?；榷鄠€階段的轉化,才能形成氫氣和脂肪酸等其他中間代謝產物。微藻暗發酵產氫的電子主要來源于丙酮酸鐵氧還蛋白酶(PFR1)催化丙酮酸的氧化,這一過程與Fd的還原偶聯在一起,最終Fd將電子轉移到氫化酶而產生氫氣[11]。該途徑一般會受到發酵產物積累的限制,特別是乙酸會損害細胞生長從而影響氫氣的產生,因此,控制pH值是提高暗發酵產氫途徑效率的關鍵[12]。此外,厭氧發酵前對底物進行預處理也可以增加氫氣產量[13]。

2 綠藻氫化酶及產氫的限制因素

2.1 [FeFe]-氫化酶

藻類產氫的關鍵酶是氫化酶和固氮酶,大多數固氮酶存在于藍藻中,其作用是促進N2轉化為NH3同時釋放出副產物氫氣。氫化酶根據活性位點結構不同,可分為[NiFe]-氫化酶、[FeFe]-氫化酶和[Fe]-氫化酶。[NiFe]-氫化酶廣泛存在于原核生物中,催化氫氣的釋放和吸收;[FeFe]-氫化酶存在于一些真核細胞和厭氧細菌中,只催化氫氣釋放[14];[Fe]-氫化酶與其他兩種酶的功能不同,它是將氫氣分解成H+和H-,僅存在于產甲烷菌中[15]。綠藻產氫的核心酶——[FeFe]-氫化酶具有獨特的活性中心——H簇,其催化活性比[NiFe]-氫化酶高出100多倍[16]。[FeFe]-氫化酶對氧氣極其敏感,只有在厭氧的環境下才具有催化活性,并且氧氣對該酶的抑制作用是不可逆的[1]。萊茵衣藻有兩種[FeFe]-氫化酶:HydA1和HydA2。Meuser等[17]研究發現,HydA1是主要的氫化酶,其對衣藻光合放氫量的貢獻約占75%,HydA2約占25%。

2.2 產氫的限制因素

限制綠藻大規模工業化產氫的主要因素有:(1)氧氣對氫化酶活性的抑制作用;(2)卡爾文循環與氫化酶競爭電子。此外,綠藻產氫是多個調節因子共同參與的復雜生理過程,如光照強度、pH值、溫度、底物濃度和生物反應器的配置等均是影響產氫效率的因素。

2.2.1 氫化酶對氧氣的敏感性

氫化酶對氧氣非常敏感,在早期研究中,研究人員曾嘗試利用含有血紅蛋白或連二亞硫酸鹽的吸氧劑和氧清除劑降低培養體系中氧氣含量,然而此類技術并不能完全克服氧氣對氫化酶的限制。

藻類的生長需要營養成分。任何微量營養素或常量營養素的缺乏都會直接影響藻類的生長狀態。因此,研究人員利用營養缺陷的方法去影響細胞代謝,進而減少氧氣對氫化酶的抑制。在光照條件下用缺硫TAP培養衣藻大約24 h后,光合作用放氧速率小于呼吸作用耗氧速率,使密閉的培養系統逐漸達到厭氧狀態,從而有利于氫氣的產生。在這期間,缺硫導致PSII中的D1蛋白合成受損,電子由淀粉等內源底物的分解代謝產生[18]。短時間缺硫可以影響光合放氧同時不影響細胞其他的生理代謝功能,但缺硫時間過長時,細胞內開始積累大量有毒物質[4],細胞的產氫速率會逐漸降低直至停止產氫。之后的一些實驗發現,培養基缺少氮、磷和鎂等元素也會引起其他代謝途徑發生變化從而造成PSII逐漸失活,細胞呼吸耗盡氧氣進而使氫化酶活性提高,然而缺硫產氫仍然是目前最有效且最實用的誘導衣藻光合產氫的方法[19]。

2.2.2 能量轉化效率

綠藻的產氫效率受溫度、pH值、光照強度、碳水化合物含量等因素的制約。在眾多因素中,pH是直接影響綠藻產氫效率的重要參數。因為pH不僅會影響綠藻的細胞活力,還會影響氫化酶的活性。Kosourov等[20]對萊茵衣藻進行缺硫處理,初始pH值為7.7時產氫量最大,而pH值降至6.5或升高至8.2時,產氫量降低。此外,溫度也是一個重要因素,微藻在15～35 ℃的溫度范圍內生長狀態最佳[21]。藻的細胞密度也是影響綠藻產氫的關鍵條件,Lakatos等[22]研究發現,在初始藻細胞密度為3.96×108個藻細胞/mL時,累積的總產氫量達(88.98±2.18) mL/L,隨著細胞密度增加,氫氣產量迅速下降。光照強度也是制約產氫效率的因素之一,綠藻吸收的光能不僅促進水分子的氧化、電子和質子的釋放,還為電子向Fd的傳輸提供驅動力,因此,通常光照強度越低,氫氣的產量也相對越低。有研究發現短暫的高光照射可以通過抑制光合放氧來增加氫氣的產生速率[23]。除此之外,在厭氧培養階段提高光強,葉綠素濃度增加,釋放的電子數量也隨之增加,這些電子能夠與質子結合形成更多的氫分子[8]。同時,為了提高光子轉換效率,還可以設計合適的光反應器來增加光的攝入量。碳水化合物含量也是一個限制產氫的重要因素。Kosourov等[24]發現萊茵衣藻在缺硫處理后,細胞淀粉含量在放氧階段大量積累,而在產氫階段明顯下降。Posewitz等[25]提出淀粉代謝在萊茵衣藻產氫過程中占據著非常重要的地位。淀粉代謝既參與依賴PSII的直接途徑,也參與不依賴PSII的間接途徑。前者淀粉降解為呼吸作用提供還原力,支撐自身的厭氧代謝活動;后者淀粉降解產生的還原當量(NADH)被氧化后進入光合電子傳遞鏈,為氫化酶提供電子。Kosourov等[26]監測綠藻在光合自養條件下的淀粉含量變化,發現其與產氫量呈正相關。這也為提高綠藻產氫效率提供了一個新方向。

3 提高綠藻產氫的策略

受多種條件限制,目前綠藻光合產氫的效率遠遠達不到工業化應用的要求。為了提高產氫效率,研究人員們利用各種手段對綠藻進行改造和優化,本節重點概述7種提高產氫效率的方法(圖2)。

①氫化酶改造;②降低體系中氧氣的含量;③減弱環式電子傳遞;④降低卡爾文循環;⑤縮小捕光天線;⑥底物預處理;⑦光生物反應器設計。圖2 提高綠藻產氫效率的策略Figure 2 The strategies to improve hydrogen production efficiency of green algae

3.1 氫化酶改造

研究人員通過對氫化酶進行遺傳改造來提高氫化酶對氧的耐受力和對電子的競爭力。Eilenberg等[27]將電子供體鐵氧還蛋白Fd與HydA進行融合并轉入萊茵衣藻中,發現該融合酶改變了細胞內特定的代謝途徑,使更多的電子流向氫化酶并表現出更高的耐氧性。Noone等[28]將梭狀芽胞桿菌的[FeFe]-氫化酶基因CaI的密碼子進行優化,融合到[FeFe]-氫化酶表達缺陷的萊茵衣藻PsaD啟動子上(該啟動子調控光系統I的PsaD亞單位表達),CaI在D66ΔHYD中成功表達并延長了產氫時間,這為改造獲得更耐氧氣的氫化酶提供了新的思路。Redding等[29]設計出PSI亞基與氫化酶融合形成的嵌合蛋白,該蛋白具有優勢競爭電子的能力,能夠從PSI的PsaC亞基FB簇截取電子,使更多的電子流向產氫途徑。Yang等[30]對來自小球藻的HydA(CsHydAc)結構進行遺傳改造,通過修飾氣體隧道周圍的氨基酸殘基A105I、V265W、G113I或V273I,以限制氧氣進入酶活性部位,當培養至第6天,突變藻株(DT-AIVW-27)產氫量迅速增加,到第11天其最大產氫量已達到70 μL/mL,為野生型的30倍。

3.2 降低體系中氧氣的含量

一些研究人員致力于通過降低細胞環境中的氧氣濃度而解除氧氣對衣藻產氫的制約,提高光合氫的產生效率。

藻類和細菌共培養降低氧氣水平。在自然界中,一些細菌與藻類形成互惠關系,綠藻光合作用產生的氧氣及碳水化合物可以支持兼性厭氧菌的生長,而細菌消耗氧氣使綠藻氫化酶活性提高,同時細菌又可以為藻類的生長提供必需的生長因子和CO2。實驗證明,藻類和細菌共培養比單獨培養的產氫量多出約50%～60%[33]。Yu等[34]將萊茵衣藻與根瘤菌共培養,發現在不同氮源條件下,萊茵衣藻的呼吸速率、葉綠素含量、淀粉積累量以及產氫量均有不同程度提高。此外在菌藻共培養的最佳比例下,向體系中間歇添加氮化物,可以實現持續近55 d產氫,最大產氫量達到226.98 μmol/mg Chl,是對照組的5.2倍。Javed等[35]通過共培養小球藻和活性污泥中的細菌可使得其產氫量為純細菌菌株的7倍。

綠藻聚集體的光合產氫新方法可以替代缺硫培養和氧氣清除劑的使用。綠藻細胞聚集體的形成會使里層細胞的光合作用因缺乏光照而受到抑制,但其呼吸作用可正常進行,氧氣被逐漸耗盡,最終在聚集體內部形成一個有利于產氫的厭氧環境[36]。綠藻聚集體產氫在常規的培養基中進行,不需要其他處理,因此,適合低成本大規模應用。研究人員證明了化學絮凝能夠分離和濃縮綠藻細胞形成聚集體,并發現可以通過商業化學絮凝劑——陽離子醚化淀粉,在原始液體培養中直接形成聚集體,從而實現11 d的持續產氫[37]。

3.3 減弱環式電子傳遞

萊茵衣藻的光合電子傳遞鏈可分為線性電子傳遞(LEF)和環式電子傳遞(CEF)。在正常生長狀態下電子傳遞以LEF為主,當LEF產生的ATP少于固定CO2所需的ATP時,光合作用將依賴于圍繞PSI的環式電子傳遞。藻類中存在兩種不同的環式電子傳遞途徑:(1)(NADH脫氫酶)NDH途徑;(2)PGR5/PGRL1介導途徑。在厭氧條件下,PGR5/PGRL1介導的環式電子傳遞能力遠高于NDH介導的環式電子途徑[38]。產氫過程中,卡爾文循環水平較低,環式電子傳遞占主導,環式電子傳遞鏈不但與氫化酶競爭電子,而且在此過程中產生的跨膜質子梯度也可能不利于氫氣的產生。因此,減弱環式電子傳遞在增強萊茵衣藻光合產氫效率方面有重要意義。Chen等[39]鑒定出缺失PGR5基因的突變株hpm91,該突變株在缺硫條件下能連續25 d產氫,產氫量可達野生型的30倍。Elman等[40]發現缺失PGR5基因的突變體可以在1 L的光合混養條件下連續產氫12 d,并探究出該突變體是通過增強葉綠體和線粒體之間的聯系從而實現在簡單的大規模培養體系中持續產氫。

3.4 降低卡爾文循環

除了環式電子傳遞,線性電子傳遞的FNR和卡爾文循環也是與氫化酶競爭Fd處電子的主要因素。由于Fd對FNR具有很高的親和力,光合作用產生的絕大多數電子直接從Fd傳遞給FNR產生NADPH,用于CO2的固定。Elman等[40]在萊茵衣藻混養體系中加入磷酸核酮糖激酶的抑制劑——羥基乙醛,從而使卡爾文循環受到抑制,產氫速率大幅提高。為了將更多的電子引導到氫化酶靶點,Günzel等[41]分析了萊茵衣藻兩種氫化酶HydA1和HydA2與不同植物型鐵氧還蛋白異構體的相互作用圖譜,發現鐵氧還蛋白Fdx7對HydA1的親和力高于對FNR的親和力,這一發現為定制電子供體提供了新的方向。此外還有研究人員利用RNAi的方法得到FNR水平降低的衣藻突變株,發現FNR下調引起光合放氧速率下降、RuBisCO含量減少以及淀粉降解率提高的現象,這些現象可能導致FNR-RNAi藻株的零氧期提前或氫化酶的電子供應增加,從而實現產氫量的提高[42]。

3.5 縮小補光天線

光捕獲是光合產氫的第一步,已有研究表明,捕光天線的存在會導致強光下微藻的能量過度吸收和浪費。減小天線尺寸可以提高光能轉化效率,進而提高衣藻產氫效率。Ho等[43]證明PSI補光天線蛋白LHCA2的缺失會影響PGR5介導的光合電子傳遞,使更多電子流向氫化酶,從而促進光驅動氫氣的產生。pgr5/lhca2雙突變體的產氫量是pgr5突變體的兩倍。Ban等[44]利用常壓室溫等離子體(ARTP)突變技術截斷萊茵衣藻的葉綠素天線,使得突變體單位細胞體積的葉綠素含量降低,該突變體產氫量達到野生型的1.8～5.2倍,說明葉綠素天線的縮小提高了光合作用效率,從而促進了氫氣的產生。Lu等[45]研究表明縮小補光天線會降低活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的產生,有助于減少產氫過程中氧化損傷對萊茵衣藻的影響,從而提高衣藻的產氫效率。

3.6 底物的預處理

微藻的生物質含量極其豐富,為了促進碳水化合物的解聚和提高微藻的生物制氫能力,通常會進行適當的預處理以破壞細胞結構的完整性,釋放儲存的碳水化合物。底物的預處理技術,如化學法、熱處理、機械法、酶處理法以及這些技術的組合,已被證明是提高氫氣產量的有效方法。Liu等[46]先對底物質量為6 g的小球藻進行NaOH處理,再將其進行酶解,發現產氫效果要好于直接酶解,可以將產氫量從每克干重22.0 mL提高至49.1 mL。Ortigueira等[47]通過對斜生柵藻進行碾磨將總產氫量從每克干重32 mL提高到116 mL。未來針對聯合預處理方法的探索將有望開發高效、能源密集型、成本效益高的生物質水解混合預處理方式[48]。

3.7 光生物反應器的優化

優化用于擴大培養的光生物反應器也是提高綠藻產氫效率的手段之一。光生物反應器(photobioreactors,PBR)是指能夠培養光合微生物以及具有光合能力的細胞或組織的裝置[49]。根據微藻生長環境是否與外界直接接觸,可分為開放式PBR和封閉式PBR兩大類。開放式PBR成本低,容易操作。封閉式PBR可以有效控制培養條件,減少污染。然而,目前現有的光生物反應器都有設備投資和運行成本高且壽命相對較短的缺點,因此,開發經濟可行的PBR系統是實現高效產氫的重要途徑。Salguero-Rodríguez等[50]嘗試在管式光生物反應器中使用一種新型靜態混合器,該混合器能夠以較低的能耗增加微藻細胞經歷明暗循環的頻率,進而實現高生產率。Cui等[51]設計出一種新型的切線雙管式光生物反應器(TDTP),與同心雙管式光生物反應器(CDTP)和傳統管式光生物反應器(TTP)相比,微藻生物量產量分別提高了51.2%和124.8%,在微藻培養中具有良好的應用前景。Nagy等[52]建立了一個基于厭氧誘導的光自養產氫反應器,通過使用密集的薄層培養,使得產氫量增加至普通培養的3倍。

研究人員還將固定化技術與光生物反應器相結合用于產氫微藻的培養。固定化技術具有反應速度快、易于操作、易于收集細胞等優點,還可以保護細胞免受污染,進而延長衣藻的產氫時間[53-54]。

4 展望

綠藻光合產氫提供了利用水和太陽能這兩種最豐富的資源去產生可再生資源的可能性,是一種前景與挑戰并存的生物技術,在解決能源及環境危機問題中發揮著重要作用。在過去幾十年里,國內外學者就如何提高微藻光合產氫效率這一問題展開了多角度的探討,進行了大量的實驗研究,提出并建立了豐富的產氫理論和實驗方法,為綠藻產氫領域的未來發展奠定了堅實的基礎。目前大部分的研究主要集中在提高氫化酶對氧的耐受性以及能量轉換效率兩個方面,前者通過基因工程的手段篩選出對氧耐受或光合放氧過程受到限制的高效產氫藻株;后者通過發掘光合作用高效吸能、傳能和轉能的分子調控機制,使更多的電子不斷流向氫化酶。

盡管目前已經開創出許多提高綠藻產氫量的方法和手段,但距離理論預期值還有一定差距,綠藻產氫的水平仍不足以使氫氣作為一種商業競爭的能源載體。未來實現綠藻光合產氫工業化應用的努力方向包括:

(1)發掘更多高產氫突變藻株。深入挖掘并研究微藻在厭氧條件下的代謝調控網絡,利用分子生物學、合成生物學等交叉學科的技術手段快速篩選高效且穩定的產氫藻株?？梢酝ㄟ^突變特定的參與光合作用的相關蛋白或氫化酶基因、改變其他代謝途徑以及將不同高產氫的表型進行組合等方式提高綠藻光合產氫能力。另外可以通過高通量組學分析突變體藻株相較于野生型藻株的代謝變化,發現更多遺傳改造的靶點。

(2)開發高效光生物反應器。實驗室小規模培養過渡到工業大規模應用需要很多硬性要求和條件,并且后續氫氣的收集、運輸和儲存都需要很大的成本。高效光生物反應器的開發是從基礎研究轉到應用研究的關鍵一步。目前開發的高效光生物反應器可以穩定并且精確控制產氫過程中的光照、溫度等基礎條件。未來高效光合反應器的設計將側重于成本低、效能高、延長產氫時間以及氫氣易收集等方面,早日形成綠藻工業化大規模培養體系。

綠藻產生的生物氫能否成為未來人類社會主要的能源供應,不僅取決于合成生物學和微生物基因工程的發展,還取決于其他高效制氫方法的成本效益,以及社會對氫能使用的接受程度。