內鏡醫師快速現場評估在行免疫組織化學染色的胰腺實性病變診斷中的應用

熊定堃 劉泳汝 馮云路 趙雨 吳晰 郭濤 蔣青偉 王強 伍東升 張晟瑜楊瑩韻 楊愛明

1中國醫學科學院北京協和醫院消化內科，北京 100730；2中國醫學科學院北京協和醫院病理科，北京 100730

作為消化內鏡診療常規的一部分，內鏡超聲引導下組織取樣（endoscopic ultrasound-guided tissue acquisition, EUS-TA）在胰腺實性病變中的價值越來越受到重視，目前已是公認安全、可靠的獲取診斷標本的重要手段[1]。根據使用的穿刺針型可將EUS-TA進一步分類為細針穿刺抽吸（fine-needle aspiration,FNA）和細針穿刺活檢（fine-needle biopsy, FNB）。相比FNB針，FNA針在獲取組織學評估所需的核心組織方面能力較弱，尤其是在缺乏快速現場評估（rapid on-site evaluation, ROSE）的情況下更是如此[2]。由細胞病理學醫師進行的ROSE可為內鏡醫師提供實時反饋，從而提高EUS-FNA標本的充分性和準確性[3]。然而由于ROSE依賴于病理醫師在場，其實際應用受到了限制[4-5]。目前已有經驗表明，經過培訓的內鏡醫師可以像細胞病理學醫師一樣準確地完成ROSE[3-4]。此外，使用具備斜面、切割、核心活檢等設計的FNB針進行EUS-TA可獲取更充足的標本，并減少針穿次數[5]。雖然內鏡醫師可以通過肉眼即宏觀現場評估（macroscopic on-site evaluation, MOSE）[6]來判定EUS-FNB是否獲取了核心組織條，但無法同ROSE一樣區分正常組織和病變組織。并且既往評價ROSE對于EUS-TA準確性影響的研究中，大部分病例為惡性腫瘤患者，意味著ROSE涂片中可以見到明顯的異型細胞從而明確診斷[3]。而對于其他胰腺實性病變如胰腺神經內分泌腫瘤（pancreatic neuroendocrine tumor, PNET）、胰腺實性假乳頭狀瘤（solid pseudopapillary tumor, SPT）、淋巴瘤及間葉源性腫瘤（包括平滑肌肉瘤、Ewing肉瘤）等，往往需要進行細胞學或組織病理的免疫組織化學（immunohistochemistry, IHC）染色以明確診斷。目前對于ROSE在此類疾病中是否真正提高了EUS-TA的準確性尚無明確結論。因此，本項單中心、觀察性的回顧性研究比較了在依賴IHC染色明確診斷的胰腺實性病變中進行有或無由內鏡醫師完成ROSE的不同類型EUS-TA的診斷效果。

資料與方法

一、一般資料

回顧性收集2018年8月至2022年10月間北京協和醫院內鏡中心1 573例行EUS-TA患者的臨床資料。納入標準：（1）經腹部超聲、CT、PET-CT或MRI證實為實性胰腺腫塊；（2）EUS-TA成功取得細胞學和（或）組織學標本；（3）6～12個月隨訪期間臨床或病理診斷明確為PNET、SPT、淋巴瘤及間葉源性腫瘤。排除標準：（1）無實性成分的胰腺囊性病變或假性囊腫者；（2）無明確臨床診斷或失訪者。最終納入65例。根據EUS-TA后內鏡醫師進行或未進行ROSE，將患者分為ROSE組（36例）和非ROSE組（29例）；根據EUS-TA使用的針型，進一步分為FNA-ROSE組（26例）、FNB-ROSE組（10例）、FNA-非ROSE組（24例）、FNB-非ROSE組（5例）。

二、EUS引導下組織取樣

EUS由7名經驗豐富的內鏡醫師完成。采用線性陣列回聲內鏡（GF-UCT260或GF-UCT240配備EU-ME2 Premier，日本Olympus公司）進行。EUS-TA選擇使用FNA或FNB以及具體的針型由內鏡醫師根據其經驗和對病灶的綜合評估（包括病灶大小、病灶位置及與周圍血管的關系）決定。FNA使用19G、22G、25G FNA針（Cook EchoTip Ultra?或Boston Scientific ExpectTM），FNB使用20G、22G FNB針（Cook EchoTip ProCore?或Boston Scientific AcquireTM）。

具體操作步驟：將內鏡經口腔插入并推進到胃或十二指腸，在識別和定位胰腺病灶后，應用彩色多普勒以避開主要血管并確保安全，找到最佳穿刺路徑，然后經胃或經十二指腸（或兩者）進行穿刺活檢。取樣方法包括干抽法、濕抽法，帶或不帶負壓[7]，穿刺針在病灶內前后移動15～20次以取得更多標本。將獲得的組織碎片均勻涂在若干張載玻片上，采用乙醇固定，將組織條固定于10%甲醛溶液中，其余樣本用于液基細胞學檢查。內鏡醫師根據獲取的樣本量酌情決定是否進行重復穿刺。所有樣本最后均送至病理科，由經驗豐富的病理醫師進一步行細胞學或組織病理學評估，必要時行IHC染色和分子生物學檢測以明確診斷。

三、ROSE操作步驟

7名內鏡醫師均已獨立完成100例以上EUS-TA操作，或在過去12個月內至少完成50例，且均已完成ROSE培訓并獲得獨立閱片資格。培訓內容包括涂片的制片和染色技術，及ROSE閱片步驟和EUSTA涂片常見的慢性胰腺炎、自身免疫性胰腺炎、胰腺導管腺癌、PNET、SPT、轉移癌等胰腺細胞病理學特征。培訓持續3個月，直到內鏡醫師能夠熟練地獨立完成標準的ROSE并通過病理醫師的考核。

在EUS-TA成功穿刺病灶后，內鏡醫師及助手將1張或多張取樣涂片風干，采用Diff-Quik染色法進行ROSE染色，隨后在床旁的光學顯微鏡下檢查是否存在異常細胞，同時評估穿刺取樣是否滿意或是否需要繼續穿刺取樣。在EUS-TA操作結束后，ROSE涂片與其他活檢標本一同送至病理科，由病理醫師進一步行細胞病理學診斷。

四、IHC染色

病理醫師對包含ROSE涂片的所有活檢標本完成評估，根據細胞病理學、組織病理學表現進一步進行IHC染色明確診斷。對疑似自身免疫性胰腺炎的切片用IgG4、CD38和CD138染色；疑似PNET的切片用CgA、Syn和CD56染色；疑似間質瘤的切片用c-kit、CD34、DOG-1、α-SMA、Desmin和S-100染色；疑似淋巴瘤的切片用CD3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD30、CD45RO、CD79a、PAX5和BCL2染色。

五、觀察指標

記錄患者的性別、年齡；EUS-TA前實驗室檢查結果包括膽紅素、CA19-9水平；影像學檢查結果包括病灶部位、病灶大??；EUS-TA數據包括病灶大小、穿刺針類型、針徑、穿刺點位置和穿刺針道數）；病理學常規及ROSE涂片、液基細胞學、組織病理學；隨訪結局。

六、統計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗；計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。使用二項logistic多因素回歸分析ROSE及穿刺類型對診斷準確性和IHC成功率的影響。診斷準確率的計算方法為比較EUS-TA的細胞學或組織病理學診斷與最終診斷（包括病理診斷、隨訪及治療結局）之間的一致性。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、各組患者臨床特征比較

65例患者中，46例（70.8%）為PNET，13例為SPT，6例為淋巴瘤及間葉源性腫瘤。病變多位于胰頭、胰頸和鉤突部（47/65，72.3%）。21.5%（14/65）的患者接受了手術治療并確診，其余患者均通過EUS-TA明確病理診斷或經過治療與隨訪達到臨床診斷。各組患者性別、年齡、直接膽紅素、總膽紅素、CA19-9及CT或MRI下病灶部位、病灶大小等臨床特征差異均無統計學意義，具有可比性（表1）。ROSE組和非ROSE組，FNA-ROSE組和FNA-非ROSE組、FNB-ROSE組和FNB-非ROSE組患者的EUS病灶平均大小以及穿刺針徑、穿刺點位置、穿刺針道數的差異亦均無統計學意義（表1）。

表1 不同類型內鏡超聲引導下組織取樣及快速現場評估分組患者的臨床特征

二、應用ROSE對診斷準確率和IHC成功率的影響

與非ROSE組比較，ROSE組有更高的診斷準確率（88.9%比79.3%），差異有統計學意義（P=0.023），但兩組的IHC成功率差異無統計學意義（P＞0.100）。在FNA-ROSE組和FNA-非ROSE組、FNB-ROSE組和FNB-非ROSE組之間進行亞組分析，未觀察到應用ROSE對于診斷準確性和IHC成功率存在顯著影響。FNA-ROSE組較FNA-非ROSE組表現出更高的診斷準確率（88.5%比75.0%），但差異無統計學意義（P＞0.100）。FNB-ROSE組和FNB-非ROSE組間診斷準確率及IHC成功率差異亦無統計學意義（表2）。

表2 不同類型內鏡超聲引導下組織取樣及快速現場評估的診斷準確率及免疫組織化學成功率（%）

進一步采用二項logistic回歸將是否行ROSE、使用的針型（FNA或FNB）、最終診斷納入多因素分析，沒有發現影響診斷準確率的獨立因素（表3）。

表3 影響診斷準確性的二項logistic多因素回歸分析

討 論

筆者所在的內鏡中心是國內最大的內鏡中心之一，率先開展了內鏡醫師實施ROSE的EUS-TA操作。本研究回溯了超過5年的病例資料，并聚焦于依賴病理切片IHC染色鑒別診斷的罕見病變，比較了ROSE在不同EUS-TA類型中的診斷準確率，旨在評估ROSE在此類疾病診斷中的有效性。

本研究結果表明，內鏡醫師完成的ROSE可以提高EUS-TA的診斷準確性。但由于本研究涉及的疾病種類的罕見性及細胞病理學特征，納入的病例中不存在假陰性及假陽性結果，因此未計算分析靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值等指標。既往的研究顯示，ROSE可將EUS-TA的診斷能力提高約15%[8-9]，本研究表明ROSE可將EUS-TA的診斷準確率提高至接近90%。

理論上，ROSE是提高EUS-FNA診斷胰腺實性腫塊準確性和敏感性的理想輔助方法，不僅可以優化穿刺策略，實時評估樣本質量和數量，而且可以在操作同時作出初步的診斷，能最大限度地減少穿刺針道數，減少重復取樣，因此被歐洲消化內鏡學會（European Society of Gastrointestinal Endoscopy，

ESGE）推薦使用[10]。然而，由于需要病理醫師的協助，ROSE的推廣在醫療資源緊缺的國家和地區受到了限制?；诖?，筆者所在中心通過由內鏡醫師開展ROSE為這一問題提出了解決方案。結果顯示，EUS-TA同時行ROSE使依賴IHC染色明確診斷的胰腺實性病變的診斷準確率提高了9.6%。類似地，Zhang等[3]的研究證實了內鏡醫師的ROSE與病理醫師對標本進行細胞病理學評估的結果高度一致，并且內鏡醫師的ROSE提高了24.7%的準確率。與既往研究中觀察到ROSE能減少穿刺針道數不同，本研究顯示ROSE組與非ROSE組的穿刺針道數差異無統計學意義，由于回顧例數較少，這一結果值得進一步觀察驗證。在既往的研究中，絕大多數病例的診斷為惡性腫瘤，病變在ROSE涂片中可見明顯的異型細胞。本研究所涉及依賴IHC染色進行診斷的胰腺實性病變在ROSE的Diff-Quick染色下的表現特征為（1）PNET，腫瘤細胞呈帶狀或小梁狀排列，細胞有豐富的顆粒狀胞質和大小一致的圓形或卵圓形核；（2）SPT，腫瘤細胞呈分支乳頭狀排列，大小一致的細胞組成微腺泡結構，腺腔狀結構內可見玻璃樣小體；（3）淋巴瘤，散在分布單一類型的淋巴細胞，可見雙核細胞；（4）間葉源性腫瘤，細胞大小一致，核卵圓形或梭形。因此，目前已有的研究是否能夠反映ROSE在PNET等疾病中的價值仍存在疑問。本研究發現ROSE對于提高EUS-TA對該類疾病的診斷準確性具有潛在價值，并且這種作用可能不受FNA或FNB針型的影響。但由于疾病的罕見以及本研究內鏡醫師的ROSE開展時間較短，可納入的樣本量受限，最終結果仍需更大樣本量的多中心前瞻性研究驗證。

目前已有較多研究表明，對于依賴IHC染色進行診斷的胰腺實性病變，EUS-FNB相較EUS-FNA具有更高的診斷準確率和IHC成功率[11-13]。但本研究中未能觀察到這樣的差異，可能由于使用FNB針型的病例數明顯少于FNA針型，存在樣本的選擇偏倚，也一定程度上解釋了在總體和亞組分析時ROSE對診斷準確率影響作用的不一致。盡管存在樣本量和針型的限制，本研究率先比較了EUS-TA在有無內鏡醫師實施ROSE情況下診斷PNET等需要IHC染色鑒別的胰腺實性病變的準確性，初步提示了ROSE在此類疾病診斷中的臨床應用價值，后續可通過前瞻性多中心臨床研究進一步驗證。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明熊定堃：數據統計分析，文章撰寫；劉泳汝：數據整理、論文審閱；馮云路：研究設計、研究指導、論文審閱；趙雨：研究指導、病理閱片、ROSE培訓；吳晰、郭濤、蔣青偉、王強、伍東升、張晟瑜、楊瑩韻：研究開展，數據收集；楊愛明：研究設計、研究指導、經費支持