基于ORAI1/NFAT 信號軸探討鎮心安神方對1-氯-2，4-二硝基苯誘導特應性皮炎小鼠的作用及機制

陳若曦，姜姍姍，楊潔，楊曉宇，徐蕊瑤，方琳，趙一?。?. 陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 71046；. 陜西省中醫藥研究院，陜西西安 710003；3. 陜西省中醫醫院，陜西西安 710003）

特應性皮炎（Atopic dermatitis，AD）是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，具有患病率高、病程長、易反復等特點，常伴有個人或家族特應性病史（如哮喘、過敏性鼻炎等）。目前全球約有2%～20%的人群受到AD 的困擾[1]，兒童多于成人。有研究[2]顯示，我國城市學齡前兒童罹患皮膚病以濕疹或AD 最為常見，患病率高達18.71%。慢性復發性炎癥和瘙癢成為影響AD 患者生活、工作和學習的最重要因素，甚至會合并焦慮、抑郁、失眠等神經系統疾病。在AD的治療方面，傳統的抗組胺藥療效不佳，糖皮質激素、免疫抑制劑、靶向單克隆抗體和小分子拮抗劑雖然能夠緩解皮損，但依然未能解決皮損復發及瘙癢等問題[3]。中藥復方在治療AD 方面體現了獨特優勢，具有抗炎、調節免疫等作用[4]。鎮心安神方是根據小兒“心常有余，肝常有余，脾常不足，腎常虛”的生理特點而形成的經驗方，組方包括龍骨、牡蠣、骨碎補、淡竹葉及茯苓，具有重鎮安神、平肝潛陽、健脾補腎之功效。課題組前期通過多中心隨機對照試驗[5]證實，鎮心安神方能夠有效緩解AD 患者的皮損和瘙癢。故本研究擬基于鈣通道調節分子1（ORAI1）/T 細胞核因子（NFAT）信號軸探討鎮心安神方對AD小鼠的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物 36只6～7周齡雌性BALB/c 小鼠，SPF級，體質量16～19 g，由三峽大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2017-0012，動物質量合格證號：42010200005530。動物以單籠方式飼養，飼養環境：溫度18～24 ℃，自由進食和飲水，晝夜12 h 交替。本動物實驗經陜西省中醫醫院倫理委員會批準，批文號：2018-101。

1.2 藥物及試劑 鎮心安神方組方：生龍骨30 g、煅牡蠣30 g、骨碎補10 g、茯苓20 g、淡竹葉30 g，配方顆粒由廣東一方制藥有限公司生產，由陜西省中醫醫院提供。1-氯-2，4-二硝基苯（1-chloro-2，4-dinitrobenzene，DNCB），日本東京化成工業株式會社，批號：H2UKD-DM；鹽酸西替利嗪滴劑，香港澳美制藥廠有限公司，批號：HC20070016；一抗鈣調磷酸酶A（Calcineurin A，CaN），英國Abcam 公司，批號：Ab282104；一抗ORAI1（批號：DF7956）、NFAT2（批號：DF6446），均購自美國Affinity 公司；白細胞介素4（IL-4，批號：E-EL-M0043c）、白細胞介素13（IL-13，批號：E-EL-M0727c）、胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP，批號：E-EL-M0646c）ELISA試劑盒，均購自武漢伊萊瑞特生物科技公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0010）、磷酸酶抑制劑（批號：S1873）、RIPA 裂解液（批號：P0013B），均購自上海碧云天生物技術公司；苯甲基磺酰氟（PMSF），上海阿拉丁生化科技有限公司，批號：P105539；兔多抗GAPDH，杭州賢至生物有限公司，批號：AB-P-R001；HRP 標記羊抗兔二抗，武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1054。

1.3 主要儀器 C2500-R-230V 型高速離心機，美國Labnet 公司；ICV-450 型電熱恒溫培養箱，日本ASONE 公司；Multiskan MK3 型全自動酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；JT-12J 型生物組織脫水機、JK-6型生物組織攤烤片機，武漢俊杰電子有限公司；2016 型輪轉式切片機，德國Leica 公司；DYY-7C 型電泳儀電源、DYCZ-24DN 型垂直電泳槽、DYCZ-40型電轉儀，北京六一儀器廠。

1.4 模型復制、分組及給藥 小鼠適應性喂養1 周后，參考相關研究[6-7]方法使用DNCB 復制AD 小鼠模型。將36只小鼠以戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）腹腔注射麻醉后，用脫毛膏及剃毛刀去除背部毛發，面積約1.5 cm×2.5 cm。然后將小鼠隨機分為空白對照組、模型組、西替利嗪組及鎮心安神方組，每組9只。除空白對照組外，實驗第1、2、3天各組小鼠背部滴涂200 μL 0.5% DNCB 溶液進行致敏；從第4 天起，改用100 μL 1.0% DNCB 溶液涂抹背部脫毛區以維持炎癥反應，每周2次，共4周，第28天取材。

實驗第14 天開始，各組小鼠以灌胃方式給藥，給藥組按照人（60 kg）和動物體表面積折算等效劑量。鎮心安神方組給予36.36 g·kg-1（按照生藥量計算）[7]鎮心安神方顆粒水溶液灌胃；西替利嗪組給予1.3 mg·kg-1鹽酸西替利嗪滴劑灌胃；模型組及空白對照組均給予10 mL·kg-1生理鹽水灌胃；每日1 次，連續給藥2周。

1.5 標本采集 采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，測定體質量后小鼠摘眼球取血，室溫下靜置10～20 min 后，以3 500 r·min-1（離心半徑=8.479 cm）離心10 min，收集上清液，速凍保存以備ELISA 檢測。剪取小鼠背部致敏區皮膚；一部分置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，用于組織病理學檢測；另一部分用液氮速凍，-80 ℃保存。摘取小鼠脾臟組織，吸干水分，測定脾臟質量，計算：脾臟指數（mg·g-1）=脾臟質量（mg）/小鼠體質量（g）。

1.6 皮損評分 參考相關研究[7-8]測定皮損面積，并對皮損嚴重程度進行評分。根據皮損處紅斑、丘疹、滲出、結痂、干燥等嚴重程度進行打分：0 分為無皮損，1分為輕度，2分為中度，3分為重度。評分越高表示AD皮損越嚴重。

1.7 皮損組織病理學觀察 取10%中性甲醛溶液固定后的小鼠皮膚組織，經脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后，在光學顯微鏡下觀察皮損組織病理變化，并測量各組小鼠皮損組織的表皮層及真皮層厚度。

1.8 ELISA 法檢測血清中IL-4、IL-13 及TSLP 的含量 取“1.5”項下凍存的小鼠血清，與試劑平衡至室溫，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，檢測血清炎癥因子IL-4、IL-13及TSLP的含量。

1.9 Western Blot 法檢測皮損組織中ORAI1、CaN、NFAT2 蛋白表達水平 取“1.5”項下凍存的小鼠皮膚組織30 mg，提取并采用BCA 法測定總蛋白濃度。采用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，并轉印至PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉的TBST 在室溫下搖床封閉2 h后，加入一抗ORAI1、CaN、NFAT2、GAPDH（均為1∶1 000），4 ℃下孵育過夜；TBST充分洗膜5～6次后，加入HRP 標記的羊抗兔二抗（1∶10 000），37 ℃搖床孵育2 h；TBST 洗膜3 次，采用ECL 化學發光法曝光顯影，拍照；采用BandScan 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內參，對目的蛋白進行半定量分析。

1.10 統計學處理方法 采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據分析；計量資料以均數±標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗，不符合正態分布或方差齊性的資料采用非參數秩和檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鎮心安神方對AD 小鼠皮損評分及皮損面積的影響 結果見圖1、表1。除空白對照組外，其他各組小鼠在涂抹DNCB 后，背部皮膚出現紅斑、丘疹等急性炎癥反應，繼而出現滲出、結痂，痂皮逐漸干燥、脫落，伴輕微鱗屑及苔蘚樣變。與空白對照組比較，模型組小鼠的皮損評分顯著升高（P＜0.01），皮損面積顯著擴大（P＜0.01）。與模型組比較，鎮心安神方組小鼠的皮損評分顯著降低（P＜0.01），皮損面積顯著縮?。≒＜0.01）。結果表明，鎮心安神方能夠明顯改善DNCB誘導AD小鼠的皮損癥狀。

表1 鎮心安神方對1-氯-2，4-二硝基苯誘導特應性皮炎小鼠皮損評分及皮損面積的影響（±s，n=9）Table 1 Effects of Zhenxin Anshen Prescription on skin lesion scores and skin lesion area of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=9）

表1 鎮心安神方對1-氯-2，4-二硝基苯誘導特應性皮炎小鼠皮損評分及皮損面積的影響（±s，n=9）Table 1 Effects of Zhenxin Anshen Prescription on skin lesion scores and skin lesion area of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=9）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對照組模型組西替利嗪組鎮心安神方組劑量/（g·kg-1）--1.3 mg·kg-1 36.36皮損評分/分0 10.11±1.27**5.00±1.32##3.88±0.93##皮損面積/cm2 0 3.52±0.27**3.19±0.33#2.89±0.35##

圖1 鎮心安神方對1-氯-2，4-二硝基苯誘導特應性皮炎小鼠皮損情況的影響Figure 1 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on skin lesion of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene

2.2 鎮心安神方對AD 小鼠皮損組織病理形態變化的影響 結果見表2、圖2。與空白對照組比較，模型組小鼠表皮層及真皮層厚度顯著增加（P＜0.01），表皮過度角化，棘層肥厚，真皮層可見嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤。與模型組比較，鎮心安神方組小鼠表皮層及真皮層厚度顯著降低（P＜0.01），表皮過度角化減輕，棘層輕度肥厚，真皮層有少量炎性細胞浸潤。結果表明，鎮心安神方可顯著改善AD 小鼠的皮膚病理損傷，降低炎性細胞浸潤水平。

表2 鎮心安神方對1-氯-2，4-二硝基苯誘導特應性皮炎小鼠皮損組織厚度的影響（±s，n=3）Table 2 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on the thickness of skin lesions tissue in atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=3）

表2 鎮心安神方對1-氯-2，4-二硝基苯誘導特應性皮炎小鼠皮損組織厚度的影響（±s，n=3）Table 2 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on the thickness of skin lesions tissue in atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白對照組模型組西替利嗪組鎮心安神方組劑量/（g·kg-1）--1.3 mg·kg-1 36.36表皮層厚度/μm 20.17±1.70 75.27±7.20**44.20±3.72##32.40±5.31##真皮層厚度/μm 139.53±17.00 263.03±27.58**206.93±17.57##188.93±13.56##

圖2 鎮心安神方對1-氯-2，4-二硝基苯誘導特應性皮炎小鼠皮損組織病理變化的影響（HE 染色，×400）Figure 2 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on pathological changes of skin lesions tissue in atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（HE staining，×400）

2.3 鎮心安神方對AD 小鼠脾臟指數的影響 結果見表3。與空白對照組比較，模型組小鼠的脾臟指數顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，鎮心安神方組小鼠的脾臟指數顯著降低（P＜0.01）。結果表明，鎮心安神方對AD小鼠具有一定的免疫調節作用。

表3 鎮心安神方對1-氯-2，4-二硝基苯誘導特應性皮炎小鼠脾臟指數的影響（±s，n=9）Table 3 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on the spleen index of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=9）

表3 鎮心安神方對1-氯-2，4-二硝基苯誘導特應性皮炎小鼠脾臟指數的影響（±s，n=9）Table 3 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on the spleen index of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=9）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白對照組模型組西替利嗪組鎮心安神方組劑量/（g·kg-1）--1.3 mg·kg-1 36.36脾臟指數/（mg·g-1）0.53±0.01 0.85±0.10**0.73±0.02##0.69±0.03##

2.4 鎮心安神方對AD 小鼠血清IL-4、IL-13、TSLP水平的影響 結果見表4。與空白對照組比較，模型組小鼠血清IL-4、IL-13、TSLP 水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，鎮心安神方組小鼠血清IL-4、IL-13、TSLP 水平顯著降低（P＜0.01）。結果表明，鎮心安神方對AD小鼠具有一定的抗炎作用。

表4 鎮心安神方對1-氯-2，4-二硝基苯誘導特應性皮炎小鼠血清IL-4、IL-13、TSLP 水平的影響（±s，n=9）Table 4 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on serum IL-4，IL-13 and TSLP levels in atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=9）

表4 鎮心安神方對1-氯-2，4-二硝基苯誘導特應性皮炎小鼠血清IL-4、IL-13、TSLP 水平的影響（±s，n=9）Table 4 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on serum IL-4，IL-13 and TSLP levels in atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=9）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白對照組模型組西替利嗪組鎮心安神方組劑量/（g·kg-1）--1.3mg·kg-1 36.36 IL-4/（pg·mL-1）78.89±11.38 255.80±10.35**118.13±8.96##132.60±10.74##IL-13/（pg·mL-1）49.72±13.68 278.77±28.51**141.11±22.94##144.05±21.43##TSLP/（pg·mL-1）46.25±9.50 166.16±13.86**72.83±11.30##79.26±9.83##

2.5 鎮心安神方對AD 小鼠皮損組織中CaN、NFAT2、ORAI1 蛋白表達水平的影響 結果見圖3。與空白對照組比較，模型組小鼠皮損組織中CaN、NFAT2、ORAI1 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，鎮心安神方組小鼠皮損組織中CaN、NFAT2、ORAI1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。

圖3 鎮心安神方對1-氯-2，4-二硝基苯誘導特應性皮炎小鼠皮損組織中CaN、NFAT2、ORAI1 蛋白表達水平的影響（±s，n=3）Figure 3 Effects of Zhenxin Anshen Prescription on protein expression levels of CaN，NFAT2 and ORAI1 in skin lesions of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=3）

3 討論

特應性皮炎（AD）無論有無皮損、急性期或慢性期，Th2 型炎癥反應貫穿了其發病的全過程。AD 導致皮膚屏障破壞后，過敏原、細菌、塵螨及機械損傷均可激活角質形成細胞（Keratinocytes，KC），活化的KC能夠大量表達TSLP[9]。TSLP是一種類IL-7細胞因子，在皮膚、氣道和眼、鼻上皮及黏膜下層等部位廣泛表達，目前普遍認為TSLP在AD、哮喘、過敏性鼻炎等疾病中發揮“開關”作用，能夠啟動Th2型炎癥反應。在AD 患者及AD 動物模型中，皮膚或血清中的TSLP 表達水平明顯升高，且與癥狀及嚴重程度呈正相關[10]。近年來有研究[11]發現，KC 中的TSLP過表達會引發小鼠強烈抓撓及出現濕疹樣皮損，而在缺乏T 細胞、B 細胞或肥大細胞（Mast cell，MC）的轉基因小鼠中，TSLP依然可以介導瘙癢信號的傳遞，說明TSLP 誘發的神經激活可以脫離免疫招募。這是由于在觸發Th2 型免疫反應的同時，TSLP 可直接作用于皮膚感覺神經元，通過激活皮膚中瞬時受體電位錨蛋白1（Transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1）傳遞瘙癢信號[12]。

KC 中TSLP 信號通路的活化受ORAI1/NFAT 信號軸的調控。由于屏障破壞后各種內、外源性蛋白酶進入表皮，觸發內質網Ca2+釋放、耗盡。隨著細胞內鈣庫排空，ORAI1 定位于KC 細胞膜上，并且呈彌散分布，當內質網鈣庫釋放時，ORAI1 隨之出現重排，啟動鈣庫操縱性鈣內流（Store operated calcium entry，SOCE），使Ca2+流入KC[13]。Ca2+濃度升高可觸發CaN去磷酸化及NFAT 的核轉位，NFAT 可誘導TSLP 的轉錄[14]。TSLP 通過與樹突狀細胞（Dendritic cells，DC）表面的TSLP 受體識別并誘導DC 成熟，促進CD4+T細胞前體向Th2 細胞分化?；罨腡h2 細胞和Th2 型固有淋巴細胞（Type2 innate lymphoid cells，ILC2）能分泌大量IL-4、IL-5、IL-13、IL-31 等炎癥因子，誘導B 細胞產生抗原特異性IgE 分子，促進嗜酸性粒細胞的成熟和募集[15]，增強肥大細胞對過敏原的識別，產生大量細胞因子和生物活性物質，從而引起免疫級聯反應。而IL-4、IL-13 等炎癥因子過表達可以誘導KC 下調表皮屏障蛋白的分泌，加劇皮膚屏障的破壞[16]。

AD好發于兒童，明代醫家萬全指出：“五臟之中肝有余，脾常不足，腎常虛，心熱為火同肝論，嬌肺遭傷不易愈”，明確了小兒“心常有余，肝常有余，脾常不足，肺常不足，腎常虛”的生理特點[17]。心主神明，而小兒始生，神識未全，多情緒不穩，易喜易怒、易驚易動，故心神易動，心火易亢。小兒生機蓬勃，發育迅速，恰應肝木少陽升發之氣，心肝火旺，君相二火妄動，內擾心神，引動肝風，風盛則癢，表現為心神不定，情緒不穩，煩躁難寐，瘙癢難耐。有研究[18]發現，心火亢盛型AD 患者體內的Th2型細胞因子表達高于其他證型，存在免疫失衡和神經系統激活，說明“心肝有余”與AD 發病的神經免疫網絡密切相關。小兒為純陽之體，生機旺盛，發育迅速，需要的水谷精微物質相對較多，脾胃成而未全，全而未壯，加之飲食不當，故常呈現脾虛之證。有研究[19]發現，應用健脾中藥治療AD 可以顯著改善患者的臨床癥狀。小兒甫生，先天之精因生長發育迅速而不斷被消耗，故腎常虛。先天父母之精氣所承載的即為遺傳信息，現代醫學已證實AD 具有一定的遺傳易感性。本研究中，鎮心安神方重用龍骨、牡蠣重鎮安神，平肝熄風，佐以淡竹葉清心除煩，針對“心肝有余”之病機；骨碎補配伍茯苓健脾補腎，針對“脾腎不足”之病機，共同發揮治療AD的作用。

綜上所述，鎮心安神方能夠改善DNCB 誘導AD小鼠的皮膚病理損傷，可能與其抑制ORAI1、CaN 及NFAT2 蛋白表達，降低血清TSLP、IL-4、IL-13 等2 型炎癥因子水平，通過免疫調節改善皮膚炎癥及瘙癢有關。