鐵自噬介導鐵死亡機制和檢測方法的研究進展*

郭 婕， 王玉龍， 麥鳳怡， 楊文濤， 梁靖蓉， 舒俊翔， 李陳廣1，△

（1深圳大學醫學部生物醫學工程學院，醫學超聲關鍵技術國家地方聯合工程實驗室，廣東省生物醫學信息檢測與超聲成像重點實驗室，廣東 深圳 518060；2深圳市第二人民醫院，廣東 深圳 518025；3華中科技大學協和深圳醫院，廣東 深圳 518052）

1 鐵死亡發生機制

在多細胞生物組織穩態的正常發育和維持過程中，以及消除受損、感染或衰老的細胞過程中依賴于程序性細胞死亡（programmed cell death， PCD）信號事件的嚴密調控。PCD主要包括細胞凋亡、壞死性凋亡、細胞焦亡、鐵死亡以及自噬等死亡方式［1］。而鐵死亡這一概念最早在2012年由Dr.Dixon提出，它是一種鐵依賴性的脂質過氧化、活性氧自由基大量累積所致的細胞死亡方式，與氨基酸、脂質和糖等生化分子的代謝生理過程緊密相關，且是心血管疾病、腫瘤和腎衰竭等疾病的病理基礎之一［2］。受到細胞內多種代謝途徑的調控，其中包括氧化還原穩態、鐵代謝、線粒體活性和氨基酸、脂質、糖的代謝等［3］。

現階段鐵死亡的主要機制有兩個，一是system Xc-/GPX4途徑，即胱氨酸（cystine）經嵌于細胞膜表面SLC7A11和SLC3A2二聚體（system xC-）進入細胞，然后被氧化成半胱氨酸（cysteine），經谷氨酸-半胱氨酸連接酶和谷胱甘肽合成酶的催化作用下合成谷胱甘肽（glutathione）。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）利用GSH能夠將脂質過氧化的過氧鍵（L-OOH）轉變為羥基（L-OH），失去其過氧化物的活性；此過程起到抑制細胞鐵死亡的作用（圖1）。另一重要途徑為鐵代謝途徑（iron metabolic），即Fe3+經轉鐵蛋白（transferrin， TF）及轉鐵蛋白受體（transferrin receptor protein 1， TFR1）攝取，被金屬還原酶（six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 3， STEAP3）。還原為Fe2+，后經DMT1、鐵代謝調節因子蛋白（ZIP8/14）轉運進入胞質不穩定鐵池（labile iron pool， LIP）。在過量Fe2+存在的情況下，可通過芬頓反應增加活性氧生成，促進過氧化脂質形成，從而誘發細胞鐵死亡。鐵在脂質過氧化的過程中介導活性氧的產生和酶活性的改變，因此，鐵代謝的許多方面，如鐵的攝取、儲存和利用等，都受到嚴格的調控，鐵代謝和鐵死亡密切相關。在正常生理狀態下，細胞內未被利用的Fe2+被鐵蛋白的重鏈亞基（ferritin heavy chain， FTH）氧化為Fe3+，Fe3+既可以儲存在鐵蛋白中，也可以通過細胞膜上的鐵轉運輸出蛋白1（ferroportin 1， FPN1）運輸出至細胞外［4］。研究發現， NCOA4與FTH1相互結合并介導FTH1發生自噬性降解，從而釋放Fe2+，這一過程被稱為鐵自噬（ferritinophagy）。鐵自噬促進Fe2+的釋放引起細胞內游離鐵的濃度升高，最終促進鐵死亡的發生［5］（圖1）。鐵自噬與多種癌癥、神經退行性疾病、心血管疾病和肝臟等疾病的發生發展過程密切相關，通過調控鐵自噬的發生將有望成為治療相關疾病的潛在治療策略和靶點［6-8］。

Figure 1.Ferroptosis signaling pathways［3］.圖1 鐵死亡信號通路

1.1 鐵死亡的關鍵指標 目前研究者主要根據鐵死亡在細胞形態、代謝和分子生物學方面的改變進行檢測。

1.1.1 形態學特征 透射電子顯微鏡是目前最為直觀的觀察手段，超微結構顯示鐵死亡時，線粒體變小、線粒體嵴消失、線粒體膜密度增加及外膜破碎等變化，但細胞核形態正常［3］。

1.1.2 細胞內亞鐵離子檢測 Fe2+的不穩定性和高反應活性，通過芬頓反應產生羥自由基，可直接與細胞膜、質膜中的多不飽和脂肪酸反應，產生大量脂質ROS，導致鐵死亡。鐵離子的變化是鐵死亡的關鍵，通過熒光探針FerroOrange、RhoNox-1和FRET iron probe 1可簡單快速高效地對活細胞內的Fe2+進行熒光成像［9-11］。

1.1.3 谷胱甘肽含量的檢測 谷胱甘肽的耗竭是細胞執行鐵死亡的重要原因之一［3］。谷胱甘肽包括還原型谷胱甘肽（reduced glutathione， GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione disulfide， GSSG）兩種形式。它的檢測原理為GSH能夠與二硫代二硝基苯甲酸反應，產生一種在波長為412 nm處有最大光吸收的黃色產物，通過比色法可對 GSH 的水平進行定量測定［12］。

1.1.4 ROS及脂質過氧化 鐵依賴性脂質ROS積累與所有途徑的鐵死亡相關。不受限制的脂質過氧化是鐵死亡的標志。因此，鐵死亡表現為脂質過氧化和ROS水平升高。目前主要使用2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate， DCFH-DA）熒光探針檢測細胞內ROS水平，DCFH-DA本身沒有熒光，可自由穿過細胞膜，被細胞內的酯酶水解生成DCFH；細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光強度間接反應細胞內活性氧的水平［13］。另外使用C11-BODIPY581/591［14］（細 胞 內）、Liperfluo［15］（細 胞內）和MitoPeDPP［16］（線粒體內）試劑的檢測，反映脂質過氧化水平。LOOHs作為脂質過氧化物的初級產物會被分解成一系列醛類化合物，檢測丙二醛（malondialdehyde， MDA）和4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal， 4-HNE）的含量，能夠在一定程度上間接反映鐵死亡中脂質氧化的程度［17］。

1.1.5 鐵死亡關鍵調控基因和蛋白水平的檢測當鐵死亡發生時，谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）、溶質載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11， SLC7A11）和TFR等主要調控分子的基因表達和蛋白表達水平會發生相應變化，利用熒光定量PCR和Western blot檢測關鍵蛋白的基因轉錄和翻譯水平的變化［7-8，17］，可為細胞鐵死亡檢測提供依據。

2 鐵自噬及過程

2014 年，Mancias［5］等通過自噬體分離和定量蛋白質組學的結合已經確定核受體輔激活因子NCOA4是負責自噬依賴性鐵蛋白降解的貨物受體，NCOA4的C末端結合了吞噬體中FTH1上的一個保守的表面精氨酸（R23），隨后FTH1在NCOA4的介導下被吞噬體“吞噬”，吞噬體逐漸擴展成一個完整的囊泡，稱之為“自噬體”，隨后吞噬FTH1和NCO4A的自噬體和溶酶體融合成一個自噬溶酶體，對FTH1進行降解，釋放鐵離子［18］。這一過程為鐵自噬（ferritinophagy）。鐵自噬是降解鐵蛋白釋放游離鐵的過程，當細胞內的游離鐵不足以維持生命活動時，細胞通過啟動鐵自噬維持鐵穩態。而鐵離子在胞內積累過多超過體內調節平衡時，過多的鐵離子則通過芬頓反應產生大量的活性氧造成細胞損傷，最終引起鐵死亡（圖2）。

2.1 參與鐵自噬的關鍵分子

2.1.1 NCOA4 NCOA4是一種雄激素受體（androgen receptor， AR）輔激活因子。以配體依賴的方式與AR相互作用以增強其轉錄活性，同時也是定位在細胞核的選擇性運載受體［19］。近年來研究表明NCOA4是鐵自噬過程中的關鍵分子，NCOA4保守的C末 端 及 NCOA4α中 的L494、L498、I489、S492、W497區段選擇性識別FTH1的R23，并結合形成NCOA4-FTH1復合體，然后與自噬相關基因LC3結合并形成自噬體，最終降解鐵蛋白并釋放游離鐵［6］。E3泛素蛋白連接酶HERC2是細胞內調節NCOA4水平的重要蛋白。當胞內鐵離子水平較高時，NCOA4與HERC2結合增強，并在泛素蛋白酶體系統中降解，有利于鐵離子儲存于鐵蛋白中［6，20］。相反，在細胞鐵離子較低時，NCOA4與HERC2的結合強度明顯減弱，使得細胞內NCOA4水平增高，大大增加了NCOA4與FTH1的結合，從而使鐵蛋白被降解，釋放出游離鐵，以補充細胞鐵水平。HERC2、FTH1兩者與NCOA4結合位點相同，這樣的競爭結合關系可以調控細胞內鐵含量的平衡及鐵自噬的發生程度［5］。

2.2.2 FTH1 鐵蛋白是細胞內鐵離子儲存的重要結構，由24個鐵蛋白重鏈（FTH1）和輕鏈（ferritin light chain， FTL）亞基組成鐵蛋白復合體，能夠儲存多達4500個Fe3+［21］。在細胞內，鐵離子主要與FTH1結合，因此FTH1在鐵超載與鐵穩態中扮演至關重要的角色。2017年Gryzik［22］的研究結果表明，每個鐵蛋白復合物最多能夠結合24個NCOA4分子。NCOA4通過C端結構域選擇性識別FTH1的亞基，并與之相結合；進一步研究發現，由于FTH1表面有16個高度保守的殘基，而FTL表面沒有，因此決定了NCOA4對FTH1的特異性識別和結合。FTH1可以結合及催化Fe2+，氧化為Fe3+［21］，從而降低芬頓反應及ROS的產生。而細胞內高濃度的鐵水平會抑制FTH1與NCOA4的結合，加速NCOA4的降解，同時導致鐵蛋白降解和抑制鐵死亡。當細胞對鐵的需求增加或處于低水平時，可增強FTH1與NCOA4結合，分解和釋放游離鐵以維持正常細胞穩態［23］。

2.2.3 自噬相關基因與鐵自噬 在特定條件下對大分子或細胞器的靶向結合并降解稱為選擇性自噬。鐵自噬作為選擇性自噬的一種，在鐵耗竭時，FTH1自噬性降解并釋放鐵離子，從而維持體內的鐵穩態。研究發現鐵自噬的發生需要自噬相關基因（autophagy-related gene， ATG）的介導［24］。微管相關蛋白1輕鏈3（MAP1-LC3），是鐵自噬發生的重要參與蛋白。 在鐵自噬發生過程中，LC3與 NCOA4-FTH1復合物結合，最終將形成自噬體。敲除或敲低ATG5和ATG7，可抑制Erastin誘導的鐵死亡，表現為細胞內游離鐵水平降低，Fe2+介導的芬頓反應減弱，ROS減少及GSH水平增加。另一方面，在自噬體膜的形成階段，ATG7可使ATG5和ATG12通過共價方式結合。在口腔鱗癌細胞中，抑制ATG7表達，可增強腫瘤細胞遷移，在機制上可能與鐵自噬受到抑制有關［25］。

3 鐵自噬的檢測

鐵自噬最終也是導致細胞發生鐵死亡，除了鐵死亡常規檢測方法外，則需針對鐵自噬過程中如FTH1與NCOA4的結合、自噬溶酶體的形成以及最后鐵離子釋放等方面進行實驗檢測，以證明鐵自噬參與介導鐵死亡的發生（表1）。

表1 鐵死亡和鐵自噬檢測方法比較Table 1.Comparative detection methods for ferroptosis and ferritinophagy

3.1 FTH1及NCOA4基因及蛋白水平的檢測 在鐵自噬過程中，NCOA4能夠結合FTH1并將其轉運到自噬體內，通過自噬途徑降解FTH1釋放游離的鐵離子。因此，NCOA4和FTH1的基因及蛋白水平的變化可以作為確定鐵自噬發生的重要指標之一。常用的檢測方法包括實時熒光定量PCR技術檢測mRNA的表達水平，Western blot、免疫熒光和免疫組化檢測細胞或組織的蛋白表達水平。Western blot作為較為常規的方法，具有高靈敏性、特異性、可重復性及可定量等優點，但在具體實驗中需結合實驗設計，檢測不同時間及誘導劑的作用，對NCOA4及FTH1的蛋白質表達變化。鐵自噬是一個通過自噬降解FTH1的過程，與此同時，NCOA4也會被泛素化降解。雖然蛋白水平下降，但 mRNA轉錄水平不一定有所變化，因此利用熒光定量PCR方法檢測NCOA4及FTH1的基因的轉錄水平變化，可以從基因表達水平上更好地了解鐵自噬的發生和調控的相關機制。

鐵死亡的不同誘導劑（表2）可明顯誘導NCOA4和FTH1的蛋白質表達水平下降。如Mancias［5］等利用Deferoxamine處理，通過減少細胞內的鐵離子，誘導NCOA4和FTH1蛋白質的水平降低。但是NCOA4的缺失抑制了鐵蛋白吞噬作用，增加了鐵蛋白水平，使細胞對Erastin更有抵抗力，但意外地對RSL3更敏感。研究發現Erastin可促進過表達NCOA4的HeLa細胞中鐵蛋白的結合作用，增加了游離鐵、脂質過氧化和對鐵自噬的敏感性，降低NCOA4和FTH1的表達。相反，RSL3沒有調節鐵蛋白吞噬作用，而NCOA4的過量表達反而延遲了RSL3誘導的細胞死亡，這表明RSL3的作用機制與鐵蛋白降解過程是無關的［26］。因此，在執行鐵蛋白吞噬過程中，鐵蛋白-鐵的釋放似乎取決于誘導劑的種類、其目標分子和細胞死亡激活的下游途徑。

表2 鐵死亡的誘導劑Table 2.Summary of the representative inducers of ferroptosis

3.2 FTH1與NCOA4相互結合 由于鐵自噬的第一步是FTH1和NCOA4的相互結合（圖2）。檢驗蛋白之間相互作用的常用方法有免疫共沉淀（co-immunoprecipitation， Co-IP）、鄰近連接酶分析（proximity ligation assay， PLA）和pull-down等技術。如Liu等運用免疫共沉淀技術，驗證了NCOA4和FTH1相互結合作用［8］。PLA也是一種較新的檢測細胞或組織中蛋白質相互作用的技術，是通過DNA寡核苷酸探針進行檢測，能放大相互作用信號，具有高度靈敏性。但Duolink-PLA不能用于活細胞，因為抗體和探針需要滲透才能找到靶蛋白。而且一些PLA試劑如酶或DNA寡核苷酸可能破壞細胞的活性。鐵自噬中FTH1和NCOA4的結合在起始階段，因而處理的反應時間很影響實驗的結果，不一定可以捕獲最好的結合時間。另一方面，pull-down技術能夠確定兩種或多種蛋白之間相互作用的檢測方法，首先要利用基因重組技術構建含有親和標簽與誘餌蛋白基因的載體，然后通過表達純化得到帶親和標簽的誘餌蛋白，該誘餌蛋白可固定在某種基質上以吸附細胞裂解液中的能與誘餌蛋白互作的蛋白，洗脫后即可得到目的蛋白，對目的蛋白進行檢測可實現誘餌蛋白與目的蛋白相互作用的分析。常見的誘餌蛋白有親和標簽包括谷胱甘肽S-轉移酶（GST）標簽、多組氨酸（6×His）標簽進和生物素biotin標簽等。如Li［27］等使用biotin-NCOA4的 pull-down實驗發現 PTBP1參與鐵自噬的過程。

值得注意的是，FTH1和NCOA4結合后，進行自噬性降解，其蛋白水平逐漸下降。因此在檢驗這兩個蛋白相互作用時，應在鐵自噬發生的早期檢測，否則將會因為蛋白質的降解而影響了實驗的結果。如Li等［7］發現LPS處理細胞6小時后FTH1的蛋白表達水平開始下降。因此應在更早期（6小時前），應用co-ip實驗技術驗證NCOA4和FTH1互作作用。

3.3 溶酶體與FTH1-NCOA4復合物形成自噬溶酶體 鐵自噬過程中，NCOA4和FTH1結合后會與溶酶體融合形成自噬溶酶體中，并發生自噬性降解（圖2），通常使用免疫熒光共定位進行分析。1973年Trump等人通過電子顯微鏡發現，溶酶體和自噬小泡中有大量的鐵蛋白顆粒，從而證實了FTH1的降解與溶酶體和自噬小體密不可分［28］。Fang等［29］通過使用溶酶體和FTH1的特異性抗體或熒光標記，驗證FTH1進入溶酶體這一過程。值得注意的是，Joseph［5］等在鐵自噬早期通過免疫熒光共定位分析發現，NCOA4的降解阻斷了FTH1進入溶酶體，也進一步說明NCOA4結合FTH1，對其與溶酶體融合的重要性。因此，也可通過敲低/除細胞內的NCOA4或FTH1，以反向驗證鐵自噬的發生。但當溶酶體發生溶解后，溶酶體膜破碎后，溶酶體標志物溶酶體相關膜 蛋白2（lysosomal-associated membrane protein 2，LAMP2）或者溶酶體的熒光探針Lyso-Tracker則較難結合到溶酶體膜上或者隨著被降解消失；因此，驗證溶酶體與FTH-NCOA4復合物形成自噬溶酶體的過程，需精確控制反應時間點?；蛘邔TH1用熒光蛋白GFP標記，同時使用溶酶體的熒光探針Lyso-Tracker，通過時差熒光顯微鏡，采用時間間隔（如15 s）不斷拍攝，捕獲熒光圖像進行融合，即可動態觀察FTH1-NCOA4進入溶酶體這一過程。

3.4 自噬相關蛋白檢測 檢測自噬相關蛋白的動態變化，有助于確認鐵自噬途徑是否被激活以及激活程度。Mancias完整提取自噬小體并采用質譜法鑒定出NCOA4為最富集的蛋白質，通過與NCOA4共定位確定了其他自噬標記物如LC3在鐵自噬中的重要作用［5］。研究表明除了LC3，自噬相關基因Atg5、Atg 7和p62在鐵自噬中都扮演重要角色。

LC3被認為是細胞自噬信號通路最為關鍵的標志性蛋白。利用Western blot檢測LC3-II/ I的比值的變化以評價自噬形成的水平?；蛘呃胢Cherry-EGFP-LC3雙熒光指示系統，Lenti-mCherry-EGFPLC3-II慢病毒感染細胞后，在非自噬的條件下，熒光顯微鏡下mCherry-EGFP-LC3-II以彌散的黃色熒光（mCherry和EGFP的綜合效果）形式存在于細胞質中；而發生自噬時，熒光顯微鏡下mCherry-EGFPLC3-II則聚集在自噬體膜上，以黃色斑點的形式表現出來（LC3-II dot or punctae）；當自噬體與溶酶體融合后，溶酶體內的酸性環境會導致EGFP熒光淬滅而最終以紅色斑點的形式表現出來。因此，可以通過LC3雙熒光指示系統監測自噬流的發生。另外，GFP-LC3單熒光系統也可以與NCOA4或FTH1免疫熒光共定位，從而直接證明鐵自噬的發生。

除了LC3外，其他自噬基因如ATG5、ATG7和p62的表達量變化也可以用于監測自噬流。因此，通過qPCR和Western blot檢測相關自噬基因的表達量也可評價自噬水平。

3.5 胞內鐵離子（Fe2+和 Fe3+）檢測 FTH1發生自噬性降解后釋放出Fe2+，因此檢測鐵離子的變化是鐵自噬的關鍵指標。目前檢測鐵離子最常用的實驗手段之一是熒光探針法，熒光探針能夠與游離鐵進行結合形成配合物，并且在特定波長下發出熒光信號，從而檢測細胞中鐵含量。例如FerroOrange是一種特異性檢測不穩定的Fe2+的熒光探針。一旦與Fe2+反應后，不可逆的生成一種橙色熒光產物（Absmax=542 nm，FLmax=572 nm）。Fe3+或其它除鐵離子以外的二價金屬離子都不會使其熒光增強。FerroOrange也不會與鐵蛋白和其它物質中的螯合鐵反應。FerroOrange具強細胞膜滲透性和低細胞毒性，非常適用于活細胞成像。Gao等［30］利用熒光共振能量轉移效應機制設計出一款對細胞內Fe3+可視化的熒光探針RhoNox-1和FRET iron probe 1。除了熒光探針外，如原 子吸 收光譜 法（atomic absorption spectroscopy，AAS）及電感耦合等離子法（inductively coupled plasma mass spectrometry， ICP-MS）也能夠檢測鐵離子。AAS是一種分析鐵離子含量的常用方法，利用特定波長的光輻射原子，使其處于激發態，然后測量其吸收的光強度。由于每種元素的原子具有特定的能級結構和光譜特性，因此可以通過測量光強度來確定樣品中鐵元素的濃度。ICP-MS技術是將樣品原子化，并使其離子化后，采用質譜進行檢測，是目前應用于量化細胞內或生物體內總鐵含量最為準確的技術之一，高精度和高靈敏是該方法的優點，但這種方法也存在一些檢測局限性，如樣品需要進行復雜的前處理、設備和操作成本相對較高，需要專業的技術人員來操作和維護設備。目前這一技術也被應用在鐵死亡的相關研究中，該技術具有靈敏度高、準確性高、適用性廣及穩定性好的特點，但在檢測鐵自噬中鐵離子變化時，二價鐵和三價鐵可能會發生相互轉化，這可能會影響它們在原子吸收光譜中的吸收峰的位置和峰高度，可以通過分離鐵蛋白的方式來檢測游離鐵離子的含量。

3.6 鐵自噬相關基因檢測 發生鐵自噬時會涉及相關基因表達的變化，這些基因的產物參與調控鐵自噬的發生，因此檢測這些基因的表達變化也是確定細胞是否發生鐵自噬的方法之一?？梢酝ㄟ^熒光定量PCR檢測鐵自噬相關基因的表達變化，同時可以進一步利用Western blot檢測驗證這些基因對應的蛋白表達水平。利用GeneCards數據庫圖（https：//www.genecards.org/），通過輸入“ferritinophagy”關鍵字，數據庫自動從125個數據庫獲取數據，整合出20個鐵自噬相關基因（表3）。同時我們通過實驗室優化和整理，獲得了這20個基因所對應的引物序列信息（表4），并使用GENEMANIA （http：//genemania.org/）在線分析工具，展示了這20個基因之間的相互作用網路關系圖（圖3）。

表3 鐵自噬相關基因的名稱和ID列表Table 3.List of ferritinophagy-related genes with gene symbol and ID

表4 鐵自噬相關基因的正向引物和反向引物列表Table 4.List of ferritinophagy-related genes with forward and reverse primers sequences

Figure 3.Gene-gene interaction analysis for the ferritinophagy using the GENEMANIA database.圖3 通過GENEMANIA數據庫對鐵自噬相關基因間的相互作用分析

4 結語

鐵死亡作為一種新的死亡方式，與多種疾病的發生發展密切相關，而自噬作為一種大分子或細胞器的降解過程，在病理情況下也會導致細胞的死亡［31］。雖然越來越多研究證實鐵死亡的發生伴隨著自噬的激活，但鐵死亡的發生并不是總依賴于自噬，可獨立于自噬的激活而存在。鐵死亡與自噬的關系目前仍未明確，其內在聯系更為復雜，需要研究者們更多的研究與探索。

鐵自噬調控機制和相關分子的研究正在迅速發展，涉及到許多復雜的調節過程。本綜述針對目前關于鐵自噬及其不同發生階段的檢測方法進行了歸納與總結。在實驗中檢測NCOA4和FTH1的結合，以及結合后發生的自噬性降解是驗證鐵自噬的關鍵。目前NCOA4是已知唯一鐵自噬受體，介導FTH1進入溶酶體，融合成自噬溶酶體。Goodwin等［32］報道了一種與NCOA4不同的鐵蛋白降解途徑，該途徑需要FIP200、ATG9A/VPS34和TAX1BP1的參與。因此后續可利用蛋白質免疫沉淀的方法來探究是否有存在除NCOA4以外的其他蛋白質能夠與FTH1結合。使用特異性抗FTH1或NCOA4抗體將FTH1或NCOA4蛋白沉淀下來，再通過質譜檢測分析與FTH1或NCOA4共沉淀的其它蛋白質，這可以促進鐵自噬相關分子機制的深入研究。針對鐵自噬的研究方法和策略仍需不斷優化和改進。例如鐵蛋白進入溶酶體的動態過程，很難用抗體檢測到動態變化。因此需要將Lenti-EGFP-FTH1以及LentimCherry-NCOA4融合蛋白的慢病毒，感染細胞或組織后進行鐵自噬檢測，同時使用溶酶體的熒光探針Lyso-Tracker Deep Red以更好地動態觀察NCOA4和FTH1結合后進入溶酶體的過程。

目前針對鐵自噬的研究方法主要是基于細胞水平研究，迄今為止，鐵自噬在體內尚無辦法可以實現測量。Howard［33］等研發了一種自噬檢測納米顆粒，能夠對自噬進行成像并在體內非侵入性地測量其通量。這些納米顆粒具有近紅外熒光色素Cy5.5的功能。通過靜脈注射，可以使用磁共振或近紅外熒光成像技術測量體內自噬體的通量。打破了自噬檢測僅限于細胞水平的局限性，實現體內檢測自噬程度，將有助于更好地了解自噬在各種疾病狀態中的作用。因此需要研發新的技術和方法，以深入地了解鐵自噬在疾病治療中的潛在作用。

本綜述主要介紹了鐵自噬研究過程中較為常見的檢測方法；在實際應用中，應針對不同的實驗設計選擇合適的實驗方法，需結合不同的檢測手段來分析鐵自噬的過程，將有助于更準確地分析鐵自噬的發生并深入探討其機制。隨著科學研究的不斷進步與發展，我們期待未來能有更多實驗技術和新型實驗設備對鐵自噬研究有更新的突破，為后續開展鐵自噬在各類疾病在的發生發展提供便捷有利的技術支持。