電針調控PI3K/AKT/mTOR通路改善血管性癡呆大鼠海馬神經元炎性和氧化損傷機制

畢珂瑤,李赫妍,蘇景超,陶樹琴,唐巍

(1.安徽中醫藥大學,合肥 230038;2.安徽中醫藥大學針灸經絡研究所,合肥 230012)

血管性癡呆(vascular dementia, VD)是由腦血管受損引起的一種以慢性進行性認知能力下降為特征的功能障礙綜合征[1]?；颊叨啾憩F為記憶功能、計算能力、人格、情緒情感、視空間能力等一系列的精神活動受損,執行功能障礙,信息處理速度遲緩。繼阿爾茨海默病之后,VD是世界上最普遍的癡呆原因之一,約占所有癡呆癥的20%,且發病率不斷攀升[2]。目前,針灸被廣泛應用于VD的臨床治療,且療效顯著[3-6]。針刺還可抑制慢性腦灌注不足導致的氧化損傷與炎癥反應,提升體內抗氧化物水平,降低炎性因子表達,抑制神經損傷[7]。其中,電針通過電流對特定穴位產生刺激,起到改善腦血管損傷并促進認知恢復的作用[8],對VD治療效果顯著,安全性高且不良反應小,可控性高于單純針刺[9]。大量醫學研究[10]均表明,磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路在控制血管生成、調節神經信號轉導、細胞增殖、代謝和凋亡等多種生理作用過程活動中發揮不可被忽視的作用,參與缺血性腦損傷、神經退行性疾病等一系列腦部疾病的發生發展。PI3K/AKT/mTOR信號通路由針刺激活后,可促進卒中大鼠血管、神經元和突觸的再生,保護神經血管單元[11]。但電針是否能通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路而改善VD患者海馬神經元損傷還需進一步證實。本研究基于PI3K/AKT/mTOR通路,探討電針百會與足三里對VD大鼠的海馬神經功能異常的改善作用以及可否降低體內炎癥反應、氧化應激水平,為臨床電針治療VD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取12～15周齡清潔級雄性SD大鼠45只,體質量為(250±20)g,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,實驗動物生產許可證號為SCXK(魯)2019-0003。飼養環境為(23±3)℃、濕度45%～55%,適應性喂養1周,術前禁食不禁水。本實驗經安徽中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(倫理號為AHUCM-rats-2021096)。

1.2 主要試劑和儀器

大鼠白介素6(intertleukin 6, IL-6)(JYM0646Ra,南京建成生物工程研究院)、IL-1β(interleukin 1β, IL-1β)(JYM0419Ra,南京建成生物工程研究院)、大鼠谷胱甘肽-過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)酶聯免疫吸附測定試劑盒(JYM1138Ra,南京建成生物工程研究院)、丙二醛(malonaldehyde, MDA)(A003-1-1,南京建成生物工程研究院)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)(A001-3-1,南京建成生物工程研究院)檢測試劑盒、Nissl染色試劑盒(焦油紫法)(B031,上海碧云天生物技術有限公司)、RIPA細胞裂解液(強)(P0013B,上海碧云天生物技術有限公司)、一抗二抗去除液(P0025,上海碧云天生物技術有限公司)、山羊抗兔IgG(ZB-2301,北京中杉金橋生物有限公司)、預染蛋白Marker(26616,美國Thermo)、ECL(enhanced chemi luminescence, ECL)超敏發光試劑盒(340958,美國Thermo)、PI3K(ab86714,英國Abcam)、p-PI3K(ab182651,英國Abcam)、AKT(4691s,美國CST)、p-AKT(4060s,美國CST)、mTOR(2972s,美國CST)、p-mTOR(5536s,美國CST)、兔抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(ZB-2301,北京中杉金橋生物有限公司)、抗小鼠/兔二步法檢測試劑盒(B001,安徽欣樂生物技術有限公司)、DAB顯色試劑盒(B011,安徽欣樂生物技術有限公司)。一次性使用針灸針(0.25 mm×13 mm,蘇州天協針灸器械有限公司)、華佗牌SDZ-Ⅴ型多功能電針治療儀(蘇州醫療用品廠有限公司)、UV-1800型紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)、CX41型顯微鏡(日本OLYMPUS)、EPS300型電泳儀、VE-186型轉膜儀(上海天能科技有限公司,Tanon)、JS-1070P型自動曝光儀(上海培清科技有限公司)。

1.3 造模方法及分組

隨機選取30只大鼠使用雙側頸動脈結扎法(2-VO)制備VD大鼠模型[12]。大鼠進行麻醉后正中切開頸部皮膚,鈍性分離出雙側頸動脈,仔細剝離其迷走神經。將清理過的雙側頸總動脈用5-0絲線雙重結扎,縫合后為預防感染,使用碘伏消毒。造模后第3天開始水迷宮試驗,每日4次,每次2 min,共5 d。測試第3天,開始記錄成績,如測試第5天,逃避潛伏期仍超過20 s即定為血管性癡呆模型[13]。造模成功后,將這30只大鼠隨機分為模型組、電針組,每組15只。剩余15只大鼠為假手術組,僅分離頸動脈不結扎。

1.4 干預方法

造模成功后第3天對電針組大鼠進行治療。參考華興邦《大鼠穴位圖譜的研制》[14],電針大鼠負極“百會”(頂骨正中,向后斜刺3～4 mm)、右單側正極“足三里”(膝關節后外側,在腓骨小頭下約5 mm處,左右各一穴,直刺7 mm)。為防止大鼠掙扎時電針脫落,使用大鼠平板式固定器將其固定。電針頻率4 Hz/ 20 Hz,強度1～2 mA,以大鼠安靜耐受為度,電針20 min;每日1次,連續2周,第7天和第14天間斷治療。其余組不進行電針治療,相同時間給予等量捉抓刺激。

1.5 Morris水迷宮實驗

電針治療結束后第2天,各組大鼠同時進行水迷宮實驗。水迷宮選用直徑150 cm、深度50 cm、水深30 cm的圓形黑色水池。將水池等分為4個象限,將1個直徑為10 cm的透明平臺放置于其中一象限。將水池注滿水,確保平臺高于水面1 cm,讓水溫平衡至室溫。前4 d為定向航行實驗,將大鼠隨機由剩余3個象限入水,登上平臺停留10 s記為尋臺成功,逃避潛伏期記為大鼠入水至尋臺成功的時間;若大鼠尋臺時間超出60 s,則人工將其放置平臺上停留10 s,記錄逃避潛伏期為60 s。第5天為空間探索實驗,平臺撤除后,在剩余3個象限內,將大鼠隨機入水,在60 s內,記錄大鼠首次穿越原平臺的時間。

1.6 取材與指標檢測

水迷宮實驗結束后,腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,將麻醉后大鼠仰臥固定,做腹正中縱切口,分離腸管,暴露腹主動脈,從腹主動脈采血。每組取5只大鼠的海馬雙側組織由4%多聚甲醛進行固定,其余海馬組織-80 ℃冰箱進行保存。

1.6.1 Nissl染色法觀察海馬區神經元狀態

將海馬切片固定包埋后脫蠟沖洗,浸染于56 ℃焦油紫染液中。沖洗干凈后再將其靜置于Nissl分化液中浸泡數秒(背景接近于無色時停止分化)。脫水后二甲苯透明后封片。光學顯微鏡下觀察,尼氏體示紫色、細胞核示淡紫色。

1.6.2 酶聯免疫吸附測定法檢測血清GSH-Px、IL-1β和IL-6含量

抽取的大鼠腹主動脈血于室溫下放置15 min后,3 000 r/min轉速離心20 min,分離上清液,參考GSH-Px和IL-1β、IL-6 酶聯免疫吸附測定試劑盒的使用說明書,采用波長450 nm酶標儀讀取,得到標準品的濃度和吸光度值后,制成吸光度值標準曲線,使用得出的公式計算IL-1β、IL-6和GSH-Px的含量。

1.6.3 生化檢測法檢測海馬區MDA和SOD含量

根據化學檢測試劑盒說明書進行腦勻漿的制備及測定。將各組大鼠斷頭取腦后稱得海馬重量,加入符合比例的預冷生理鹽水(4 ℃),將組織勻漿器勻漿出的勻漿液以3 000 r/min離心10 min,冷凍保存上清液制成10%的組織勻漿。參考MDA、SOD試劑盒說明書分別對勻漿中MDA和SOD含量進行測定。MDA檢測將0.5 mL離心管中加入0.2 mL MDA工作液和0.1 mL上清液,蓋上管蓋,蓋上用針扎一小孔,旋渦混勻器混勻,95 ℃水浴40 min后,沖洗冷卻,3 500～4 000 r/min離心10 min,測量上清液532 nm處吸光度。SOD檢測將配制后的工作液加入樣品中,混合均勻,37 ℃孵育20 min,450 nm處酶標儀讀數。

1.6.4 Western blot法檢測海馬組織中PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT及p-mTOR蛋白表達水平

裂解海馬組織,提取總蛋白,BCA蛋白定量,對提取總蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、轉膜、抗體封閉,加入GAPDH、PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT及p-mTOR一抗工作液(除p-AKT1:2 000外,其余均為1:1 000),在4 ℃下孵育過夜。以二抗(1:20 000)室溫孵育l.2 h后,ECL發光試劑盒檢測,凝膠成像儀拍照,GAPDH作為內參,Image J軟件進行條帶灰度值的分析。

1.6.5 免疫組化法檢測海馬區mTOR陽性表達水平

取上述制備好的海馬切片,固定包埋后脫蠟沖洗,高壓修復抗原后,室溫在3% H2O2溶液中孵育,PBST沖洗3次。滴入山羊血清,37 ℃封閉20 min。滴加一抗mTOR(1:500),4 ℃緩慢搖動孵育過夜。PBST沖洗3次。滴入二抗,37 ℃孵育20 min,PBST沖洗3次。DAB顯色后蘇木素溶液復染,脫水后封片,光學顯微鏡觀察結果。使用Image-Pro Plus軟件分析海馬區mTOR免疫組化染色的平均光密度。

1.7 統計學分析

采用SPSS22.0軟件對數據進行統計分析。計量資料符合正態分布以均數±標準差表示,多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(方差齊時)或Dunnett’s T3(方差不齊時);不符合正態分布比較采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠空間記憶和學習能力比較

與假手術組比較,模型組逃避潛伏期和空間探索首次跨越秒數明顯延長(P＜0.01);與模型組比較,電針組逃避潛伏期和空間探索首次跨越秒數明顯縮短(P＜0.01)。詳見表1。

表1 3組大鼠平均潛伏期比較(±s) 單位:s

表1 3組大鼠平均潛伏期比較(±s) 單位:s

注:與假手術組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01。

組別 n 逃避潛伏期 首次跨越時間假手術組 15 21.37±3.62 13.39±2.17模型組 15 42.15±6.771) 46.72±8.621)電針組 15 31.61±4.672) 25.25±5.872)

2.2 3組大鼠海馬神經元形態比較

Nissl染色結果可見,假手術組神經細胞無明顯損傷,尼氏小體清晰可見。與假手術組比較,模型組大鼠神經細胞緊縮,呈空泡性,尼氏小體溶解破碎,數量減少,胞漿深染。與模型組比較,電針組尼氏小體數量增多,細胞固縮減少溶解破碎減輕且形態較好。詳見圖1。

圖1 3組大鼠海馬神經元形態比較(×400)

2.3 3組大鼠血清IL-1β、IL-6和GSH-Px含量比較

與假手術組比較,模型組大鼠血清因子IL-1β和IL-6含量顯著升高(P＜0.01),GSH-Px含量顯著下降(P＜0.01),與模型組比較,電針組大鼠血清LL-1β和IL-6含量顯著降低(P＜0.01),GSH-Px含量顯著升高(P＜0.01)。詳見圖2。

圖2 3組大鼠血清IL-1β、IL-6和GSH-Px含量比較(±s, n＝15)

2.4 3組大鼠海馬MDA和SOD含量比較

與假手術組比較,模型組大鼠海馬區MDA含量顯著升高,SOD含量顯著下降(P＜0.01)。與模型組比較,電針干預組大鼠海馬區MDA含量顯著下降(P＜0.01),SOD含量顯著升高(P＜0.01)。詳見圖3。

圖3 3組大鼠海馬MDA和SOD含量比較(±s, n＝10)

2.5 3組大鼠海馬區p-PI3K、p-AKT及p-mTOR蛋白表達水平比較

與假手術組比較,模型組大鼠海馬區p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達水平顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較,電針組大鼠海馬區p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平顯著升高(P＜0.01)。詳見圖4。

圖4 3組大鼠海馬組織中p-PI3K、p-AKT及p-mTOR蛋白表達水平比較(±s, n＝10)

2.6 3組大鼠海馬組織mTOR蛋白表達比較

鏡下可見,mTOR在免疫組織化學染色后顯示為棕色或淺黃色,位于細胞質中。mTOR蛋白陽性表達在假手術組大鼠海馬神經細胞散在可見。與假手術組比較,模型組mTOR的蛋白表達下降(P＜0.01);與模型組比較,電針組mTOR蛋白表達上升(P＜0.01)。詳見圖5。

圖5 3組大鼠海馬組織mTOR表達比較(×500,±s, n＝5)

3 討論

血管性癡呆(VD)屬中醫學“癡呆”范疇,疾病表現為本虛標實,虛實夾雜,其本為腎精不足,以致腦失滋養,腦髓空虛,其標為氣血津液逆亂,以致痰濁蒙竅,瘀阻腦絡。標本錯雜交互,互為因果。督脈和足陽明胃經皆循行于腦?！鹅`樞·經脈》:“胃足陽明之脈……循發際,至額顱?！薄端貑枴す强照摗?“督脈者……上額交巔上,入絡腦?！彼^經脈所過,主治所及。督脈為“陽脈之?！?上絡于腦,可補腦髓之充盈。百會位于巔頂,屬督脈之要穴,為百脈之會,素有醒神益智、充養腦髓之效;足三里屬足陽明胃經要穴,可補后天之脾胃以滋先天之腎精。故本實驗選取足三里與百會相配可達到標本兼治、養精益髓、清濁開竅之效。VD若經過早期有效的治療,具有一定可逆性[15]。

近年來研究[16]表明,針刺可從多方面改善VD病理進程,抑制大腦神經元的凋亡,緩解腦損傷后的氧化應激和神經元炎性損傷,調節神經遞質和葡萄糖的代謝,一定程度提升認知功能,恢復大腦血管功能和突觸可塑性。其中,有學者認為血管病變會導致認知能力下降[17],VD大鼠多伴有認知和記憶障礙。由游離核糖體和粗面內質網構成的尼氏小體位于神經元的胞體和樹突內,是神經元功能狀態的參考標志[18]。VD大鼠的血管損傷是神經元損失和突觸解體的主要原因,導致神經系統評分降低并增加梗塞體積、DNA損傷和神經元凋亡[19]。SHANG N等[20]發現長期鋁暴露導致神經毒性積累和神經細胞壞死誘發的認知障礙,可以通過上調PI3K/AKT/mTOR通路緩解,mTOR活性是發揮該通路作用的關鍵因素。PI3K/AKT/mTOR是由PI3K和其下游分子絲氨酸/蘇氨酸AKT組成的重要通路[21]。激活的PI3K在細胞膜上產生第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸,在細胞中與AKT結合。AKT由細胞膜轉移到細胞質內部,被磷酸化和激活,隨后其再磷酸化細胞質和細胞核中的一系列底物,其中mTOR是最重要的底物之一[22]。磷酸化的mTOR可直接反應mTOR的活性,mTOR可作用于下游的諸多因子并且調節機體多種細胞過程,如細胞自噬、細胞周期、細胞存活、細胞生長等[23]。有研究[24]發現雷帕霉素可能通過調控PI3K/ AKT/mTOR信號通路抑制神經細胞凋亡和促進線粒體吞噬而發揮改善血管性癡呆后的認知障礙作用。CHEN S等[25]研究發現,通過apoE模擬肽激活腦出血小鼠髓系細胞觸發受體,調控下游靶點PI3K/AKT信號通路,可抑制神經炎癥和細胞凋亡。本研究Nssil染色結果可見,VD大鼠神經細胞固縮,尼氏小體破碎溶解;電針后神經細胞形態得到明顯改善,尼氏小體清晰可見且數量增多,表明大鼠神經元損傷的改善可能與電針上調PI3K/ AKT/mTOR信號通路有關。Morris水迷宮可以測試大鼠海馬依賴性學習,包括獲得空間記憶和長期空間記憶[26]。本研究顯示,電針組大鼠逃避潛伏期和空間探索實驗首次跨越秒數顯著縮短,表明電針可促進VD大鼠空間記憶和學習能力的恢復。

PI3K/AKT/mTOR信號通路可參與調控腦損傷后的神經元功能障礙,發揮神經保護作用[27]。WANG Y等[28]發現嗅三針干預阿爾茲海默癥大鼠,上調PI3K/AKT/mTOR信號通路,可保護海馬突觸可塑性功能,緩解神經炎癥反應和神經細胞凋亡。VD患者血管組織損傷及神經變性影響其先天免疫,激活白細胞和抗原呈遞細胞,加劇炎癥反應[19]。海馬神經炎癥是導致VD患者的缺血性損傷的過程之一[29]。IL-1β、IL-6為典型促炎細胞因子,長期產生可在神經細胞與神經纖維束之間的炎癥過程中引起細胞毒性作用[30]。此外,研究發現百會透曲鬢頭針療法可減輕大鼠腦出血后血腫周圍的炎癥反應,顯著降低IL-1β、IL-6含量[31]。本實驗研究發現,電針上調VD大鼠PI3K/AKT/mTOR信號通路后可顯著降低其血清IL-1β、IL-6含量,緩解腦部血管受損后的炎性反應。

氧化應激也是腦缺血類疾病的一個關鍵特征,內皮一氧化氮合酶和活性氧的結合導致脂質的異常分解,致使有毒產物的沉積,促進了DNA損傷和細胞凋亡[32]。MDA是多不飽和脂肪酸的最終產物[33]。SOD是反映清除氧自由基能力的關鍵酶。GSH-Px是一種非蛋白質抗氧化劑,經常被用作脂質過氧化物的指標[34]。研究[35]發現,N-金剛烷基-4-甲基噻唑-2-胺通過PI3K/AKT/mTOR信號通路可抑制皮層神經元中自噬細胞死亡,此通路對增強皮層神經元抗氧化酶活性,降低活性氧導致的一系列氧化應激損傷發揮相對的調控作用。慢性腦灌注不足期間腦循環減少可誘導線粒體損傷和功能障礙,提高氧化應激水平[19]。本實驗研究發現,電針組大鼠海馬區MDA含量降低,SOD、GSH-PX含量增加,氧化損傷得到明顯改善;VD大鼠海馬區p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平顯著降低,電針后大鼠p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平顯著升高。VD大鼠電針治療后,海馬區mTOR蛋白表達水平顯著增加?？梢娡ㄟ^激活PI3K/Akt從而激活mTOR,可緩解VD大鼠海馬損傷并改善其認知功能。本實驗因未設置通路抑制劑組作為對照,電針對VD大鼠PI3K/AKT/mTOR信號通路的調控作用仍不夠確切,稍顯欠缺,實驗設計仍有較大進步空間。

綜上所述,電針可通過上調PI3K/AKT/mTOR通路,保護VD大鼠海馬神經元,降低氧化應激與炎癥水平,為臨床治療VD提供實驗依據。