作物耐低氮機制的研究進展

符晶晶 李佳佳 徐翎清 周國慶 劉大麗

摘要： 氮（N）是作物的主要營養來源，低氮會限制作物的生長和產量，而過多的氮肥施用雖然在一定程度上能夠提高作物產量，但也會造成氮肥利用效率低及資源浪費。開發具有較高的低氮（LN）耐受性或氮利用效率（NUE）的作物品種，對于農業可持續發展至關重要。本文主要從作物對氮的吸收、低氮對作物生長和作物產量的影響、作物對低氮環境的適應機制、耐低氮基因型篩選、氮高效基因的研究進展5個方面綜述作物對低氮的應答機理。耐低氮基因型作物主要通過改變根部性狀（如更多側根、增大根表面積等），調控相關的代謝酶（如硝酸還原酶、谷氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶）及褪黑素等表型和生理活動調節，以改變其代謝所需能量，從而適應低氮脅迫。此外，QTL定位、轉錄組學、全基因組關聯分析等挖掘出一系列與氮高效利用相關的基因（如 ?OsNIGT1、GLN1.3、NRT1.1、ZmNAC36、BnaA04g07450 ?等），為進一步作物耐低氮分子育種提供理論參考。

關鍵詞： 低氮脅迫；適應機制；基因型；耐低氮基因；氮利用效率

中圖分類號：S184 ?文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）02-0011-07

氮（nitrogen，N）不僅是蛋白質、核酸和磷脂等細胞組分的主要成分，還是作物生長最重要的營養物質之一［1］。同時，氮是葉綠素的重要組成部分，氮素含量與光合作用密切相關［2］。因此，缺氮會影響作物的一系列生理活動和表型，最終導致作物的生物量下降［3］。人們試圖通過大量施氮肥來提高作物產量，但研究表明，僅有30%～40%的氮素被利用［4］，未被吸收的氮以土壤侵蝕、微生物利用、氮淋溶、氮揮發、硝化等方式流失，并引發嚴重的環境問題［5］。因此，如何降低氮素使用量并提高作物的氮利用效率（nitrogen use efficiency，NUE），是目前亟待解決的問題。

1 作物對氮的吸收利用

作物能夠從土壤中吸收無機氮和有機氮。無機氮包括銨鹽和硝酸鹽，它們是作物氮素吸收的主要形式，可被同化為氨基酸，如谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等；有機氮則主要包括氨基酸、多肽、蛋白質等［6-7］。

1.1 硝態氮的吸收與同化

硝態氮是土壤中無機氮的主要存在形式［8］。作物根系從土壤中吸收硝態氮，受硝酸鹽轉運蛋白調控，這些轉運蛋白主要是NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2等NRT家族蛋白［9］。硝酸鹽被根系吸收后，可以貯存在細胞的液泡中，或者被根表皮和皮層細胞同化。多余的硝酸鹽通過木質部導管輸送到葉肉細胞，并在葉肉細胞的液泡中暫時儲存。硝態氮還原為銨，需要2個連續反應：首先，NO-3在細胞質中被硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）還原成亞硝酸鹽；然后，亞硝酸鹽再通過亞硝酸還原酶（nitrite reductase，NiR）在葉綠體中進一步還原成NH+4，由此形成氨基酸［10］，進而在作物體內發揮功能。

1.2 銨態氮的吸收與同化

作物對銨態氮的吸收主要通過銨轉運蛋白（ammonium transporters，AMTs）來完成。銨轉運蛋白（AMTs）包括 AMT1、AMT2這2個家族［11］。例如，水稻是被鑒定出含銨轉運蛋白基因最多的植物種屬，發現4個亞類包括 10 個銨轉運蛋白基因： ?OsAMT1 1、OsAMT1 2、OsAMT1 3、OsAMT2 1、OsAMT2 2、OsAMT2 3、OsAMT3 1、OsAMT3 2、OsAMT3 3、OsAMT4 ?［12］。AMTs也可被劃分為高親和轉運蛋白、低親和轉運蛋白2種類型；其中AMT1屬于高親和銨鹽轉運蛋白，主要負責植物根中銨鹽的吸 收［13］。研究發現，水稻中編碼 ??OsAMT1 1、OsAMT1 2、 OsAMT1 3 ??的基因主要在根中表達，在低氮和中氮水平下， ?OsAMT1 3 ??基因在氮低效型品種中的表達量低于氮高效型品種［14］。在苜蓿、小麥、水稻等作物中，均鑒定出AMTs基因［15］。銨鹽的同化可以通過光呼吸作用發生在根或莖中［16］。 銨在葉片或根中通過谷氨酰胺合成酶（glutamine synthase，GS）- 谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT）途徑結合到有機分子中［17］，產生多種氨基酸，在作物的氮代謝過程中發揮作用。NH+4在GS 的作用下結合谷氨酸并消耗1分子ATP生成谷氨酰胺（glutamine，Gln）；Gln可刺激GOGAT活性，從而將谷氨酰胺的?；鶊F轉給α-酮戊二酸，產生2分子谷氨酸（glutamic acid，Glu）。當銨態氮同化形成Glu或Gln后， 會通過氨基酸轉移酶反應，形成其他各種氨基酸［18］，在作物抗性方面發揮相應作用。

2 低氮對作物生長和作物產量的影響

一般情況下，低氮營養會導致作物生長緩慢、葉綠素合成降低，從而造成葉片變黃、植株矮小、產量下降［19］。研究表明，低氮環境可抑制小麥、玉米的生長，導致作物植株矮小、分蘗較少、產量下降［20-21］。由于作物在繁殖期主要以開花、結實為主要特征，而氮缺乏則會使其過早衰老、生長遲緩，出現莖干變薄、矮化、木質化等現象，從而影響結實和生物量積累。在辣椒成熟期，如果降低氮的供應量，會顯著降低果實中的氮含量和干物質積累量，最終導致減產［22］。因此，氮的供給情況直接關系到作物的表型、產量和品質［23］。

低氮會降低作物的光合作用和葉面積。在生育期低氮逆境下，作物葉片中的氮含量、光合酶類及類囊體中的氮含量下降，進而影響植株的光合作用。在低氮脅迫環境下，水稻和菠菜的葉綠素含量會明顯降低，葉片的光合作用也會降低［24-25］。此外，低氮脅迫還會造成作物葉綠素PSⅡ光化學屬性的變化［26］，而作物產量與光能吸收率、光能利用率之間存在很大的相關性，因此光合作用減弱會造成產量下降［27］。由于葉中氮和葉綠素之間存在著較強的相關性，故可通過增加葉中氮含量來提高葉綠素含量，進而促進作物的光合作用［23］?？偟膩碚f，氮素供應不合理，會對作物的生長發育、產量形成和質量產生嚴重的影響。

3 作物對低氮環境的適應機制

根是作物吸收養分和水分最重要的器官，在增強作物對脅迫的適應能力方面發揮著重要作用。研究表明，低氮環境會對作物根系形態造成明顯的影響，作物根系會隨著環境中氮含量的變化而進行適應性的調整，比如改變根系的長度、增加不定根及根毛數量等［28］。一般情況下，低氮環境會促進根系相對生長量的增加，側根增多，直徑降低，主根伸長，以有效擴大根系與土壤環境的接觸面積，進而提高對氮素營養的吸收量。在低氮脅迫下，養分會優先向根部分配，抑制地上部的生長，從而使根冠比明顯提高［29］。在不同的作物中，根部結構對低氮脅迫的反應是不一樣的。例如，在低氮供應條件下，大豆的主根會顯著變短［30］，而水稻根系顯著變長［31］，玉米在低氮脅迫下，其根系長度、表面積及側根數均增加［32］。研究發現，在低氮脅迫下，氮高效利用型玉米自交系的平均根長、總根長、側根密度的數值都比氮低效利用型玉米自交系大［33］，這也說明根的構型重建對作物氮素的吸收與利用起著重要作用。

氨基酸大量存在于作物葉片中，其代謝產生的能量用于促進作物生長。通常認為，作物長時間處于低氮條件下，會使體內氨基酸的累積量減少［34-35］。某些氨基酸可以緩解非生物脅迫［36］。Schlüter等發現，在低氮脅迫下，玉米葉片中氨基酸同化下降，導致蘋果酸含量不斷降低，從而減少低氮對作物的傷害［37］。作物在低氮脅迫下會產生相應的適應機制。Li等研究發現，野生大豆對氮素的抗性主要表現在提高三羧酸循環，合成關鍵氨基酸，積累可溶性糖類、有機酸等代謝物，并形成有益的次級代謝物等方面［38］。Liu等對谷子苗期的低氮耐受性進行研究，結果顯示在低氮脅迫下，耐低氮谷子品種的葉綠素含量及硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、葡萄糖脫氫酶活性等指標都比不耐低氮品種的高［39］。Zhang等以氮高效、氮低效2種大白菜為試驗對象，通過高通量RNA-seq技術，對它們受氮素調控后的全基因組基因表達模式進行比較分析，結果表明，2種植株的葉綠素（chlorophyll，Chl）含量及凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）無明顯差異，但硝酸鹽運輸、生長素合成及谷氨酸脫氫酶合成等關鍵基因的表達量有顯著不同［40］。其他代謝酶在低氮環境下也起著重要的作用。在氮素供應不足時，莽草酯類代謝途徑關鍵酶和苯丙烷類化合物合成關鍵酶基因同時被激活［41］，褪黑素也被發現可參與調控低氮脅迫下氮素的代謝過程［42］。此外，亞硝酸鹽還原酶、葉綠體谷氨酰胺合成酶、鐵氧還蛋白依賴性谷氨酸合成酶、天冬酰胺合成酶在大麥低氮耐受功能中發揮重要作用［43］。

總之，作物能夠感受外界低氮環境，并利用自身的根系結構等表型改變以及體內的相關調節物質來適應低氮環境。

4 作物耐低氮基因型篩選

可通過篩選和創制耐低氮品種的方式，來解決農田氮肥利用效率低下的問題，實現環保和氮素高效利用。在低氮環境中，耐低氮基因型作物的產量、NUE與其他品種有明顯差異。它們的根系生長勢強，可以吸收盡可能多的氮素，供給地上部合成光合產物，再將光合產物分別輸送到其他組織［44-45］。構建耐低氮評價體系，可以高效篩選不同類型的耐低氮作物。陳二影等認為，不同谷子品種在苗期氮素利用效率上存在明顯差別，將79個基因型按2種氮素水平的干物質利用效率分為雙高、雙低、高氮高效、低氮高效4個類型［46］。陳凌等認為，在籽粒耐低氮能力評價體系中，通常采用穗粒質量、青草質量、氮素吸收速率作為評價的主要指標［47］。鐘思榮等在低氮、常規氮供給條件下，利用莖葉氮積累與地上部干質量的相對數值，將煙草分為耐低氮基因型和氮敏感基因型［48］。Muchow研究發現，生物量、氮素含量、產量等性狀與氮素利用率之間存在顯著的相關關系［49］。劉秋員等以長江中下游地區的水稻為研究對象，通過建立水稻氮素生理利用效率、氮肥回收效率、籽粒產量效率、氮肥農業利用效率等指標［50］，采用熵加權的方法，對水稻氮素利用效率進行綜合評估，建立水稻氮素高效類型評估系統［51］。

在氮素高效評估系統中，氮素吸收率、氮素利用率等是主要指標，可據其將作物劃分為不同的基因型，劃分好的耐低氮基因型可為氮高效育種縮短選種時間。關于氮素高效品種基因篩選的研究還較少，仍須深入研究以期為氮高效育種打好基礎。

5 作物耐低氮基因資源的挖掘

利用遺傳改良技術，培育低氮高效的作物新品種，已成為當前農作物氮素利用研究的熱點。實施基因工程最關鍵的是對功能基因的挖掘。

5.1 QTL定位

連鎖分析（linkage analysis），也稱為QTL（quantitative trait loci）定位，是指利用與QTLs連鎖的分子標記構建遺傳連鎖圖譜，定位目標QTL在染色體上的位置和互作效應［52-53］。在這些數據中，構建連鎖圖譜是QTL定位的基礎，分子標記覆蓋度和群體遺傳多樣性會對連鎖分析結果產生直接影響［54］。在大麥的QTL研究中，以品種Baudin、CN4079構建的RIL群體為材料，設置不同的氮濃度進行大田試驗，對其表型及QTL定位，發現在2H、3H、5H、6H、7H染色體上控制大麥性狀的24個QTLs，其中包括14個低氮特異表達的QTLs［55］。在玉米中，利用低氮脅迫相關的重要農藝性狀的212個數量性狀位點進行Meta分析，確定21個與低氮耐受性顯著相關的共識QTLs （consensus QTL，cQTL）［56］。為了開發同時具有耐低氮性和耐干旱性的水稻，Feng等通過分離失真法和全基因組關聯研究，在水稻的3組性狀特異性漸進系中鑒定了79個DT-QTLs和387個LNT-QTLs；通過試驗分析，得到4個符合預期的株系（PL6、PL36、PL50、PL66）存在重要等位基因，且表現出較強的干旱和低氮耐受性［57］，為水稻復雜的數量性狀育種提供了理論依據。在水稻氮高效QTL上也取得研究進展，研究者在高氮和低氮條件下培養水稻品種F67、OM68雜交的重組自交系群體，QTL分析發現，2號、6號、11號染色體上存在同一個與氮高效利用率相關QTL［58］。QTL定位多應用于作物抗逆性基因的定位，為進一步的組學分析提供了路徑。

5.2 轉錄組學的應用

伴隨著測序技術的不斷發展，RNA-seq已經成為轉錄組學分析的主要方法［59］。轉錄組學研究在深入挖掘新基因、發現低豐度基因、鑒定基因家族、確定代謝通路等方面，起著舉足輕重的作用，被廣泛應用于對作物的多種生物和非生物脅迫差異表達基因研究中［60］。

張婷婷等利用氮高效馬鈴薯品種冀張薯12號和氮低效馬鈴薯品種尤佳70，通過30 d低氮處理、轉錄組測序和差異基因分析，發現在低氮條件下，冀張薯12號根和葉中GS基因上調，而尤佳70號GS、GOGAT基因卻下調，推測GS、GOGAT基因與氮高效利用有關［61］。為了探究高氮利用率的分子機制，中國科學院研究人員對比分析小麥高氮利用率品種KN9204和低氮利用率品種Jing411的基因組和轉錄組學數據，結果顯示，缺氮抑制Jing411幼穗中細胞分裂相關基因的表達，從而使其對低氮敏感［62］。郭凱杰等發現，在低氮條件下，含氮素利用高效QTL的玉米SSSL10.04比親本許178有更高的氮積累量，且地上部的氮利用率更高；KEGG分析結果表明，SSSL10.04在低氮條件下表現出更強烈的逆境適應調控，原因在于其根部有更多參與呼吸、抗氧化及氨基酸代謝的基因表達，而葉片則有更多參與抗氧化、作物激素合成及物質運輸的基因表達［63］。丁慶倩等以谷子品種鄭204為材料，利用高通量測序技術，篩選到1個在谷子根系和葉片中顯著高表達的MYB家族轉錄因子 ?SiMYB42 ?，該基因存在于細胞膜和細胞核中，可能通過調節NRT2.1、NRT2.4、NRT2.5等硝酸鹽轉運蛋白的表達，從而調控氮代謝過程，提高谷子對低氮脅迫的耐性［64］。在纖維作物棉花的研究中，薄義博以氮高效、低效2種類型的陸地棉為材料，通過7、14、21 d的低氮處理和轉錄組測序，發現顯著差異的基因有433個；KEGG結果顯示，2種陸地棉中差異基因主要集中在谷氨酸代謝、激素信號轉導、類胡蘿卜素生物合成等途徑，在低氮脅迫下，GAD基因的表達在陸地棉中上調，在海島棉中卻下調，于是推測GAD基因的表達可能是導致2種棉花在低氮脅迫下存在差異的原因［65］。

5.3 全基因關聯分析

全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）是一種對全基因組的遺傳學研究，用來在自然群體中發現與性狀相關的變化，是一種分析復雜性狀解析的強大工具，已經被充分應用于水稻等作物中［66］。錢前院士團隊以230份水稻為研究對象，結合轉錄組數據以及基因組測序數據進行全基因組關聯分析，篩選到3個與氮高效相關的候選基因 ?OsNIGT1、LOC-Os05g45020、LOC-Os06g43090 ?［67］。此外，全基因關聯分析在蕓薹屬作物中的研究也較多。在對304份不同甘藍型油菜種質進行的SNP 基因分型和全基因組關聯分析中，發現11個單核苷酸的多態性與3個低氮耐受性狀相關，并在這些SNPs附近發現3個重要基因（ ?GLN1.3、 NRT1.1、NRT1.6 ?）［68］。在作物根系的研究中，Wang等通過GWAS和轉錄組測序發現玉米根系的耐低氮基因；該試驗選用213份玉米自交系，在低氮和正常氮條件下培養，測定玉米的22個根系性狀的自然變異，然后進行轉錄組測序和全基因組關聯分析，篩選出候選基因 ?ZmNAC36 ?，并對其進行重測序驗證，發現該基因在根系耐低氮方面發揮重要作用［69］。對304份油菜苗期進行高氮和低氮處理，采用60kSNP對304 份油菜進行基因分型，發現3個候選基因（ ?BnaA04g07450、BnaA07g09690、BnaA09g47380 ?） 與耐低氮性狀相關，推測這3個候選基因與耐低氮有關［68］。以上研究為低氮耐受性的遺傳調控提供了有價值的信息，可用于作物低氮耐受性的標記育種研究。

6 氮高效基因研究進展

隨著生物技術的不斷發展和創新，現代育種學者利用基因組學技術在作物中挖掘到多種與氮利用效率相關的基因，為氮高效育種提供更多可能。近年來，水稻全基因組序列逐漸完善，氮高效基因的全基因組關聯分析成為水稻研究的熱點。Wang等發現，水稻抽穗期7（heading date7， ?Ghd7 ?）基因能夠與NUE負調控因子ABC1 ressor1 （ ?ARE1 ?） 結合，抑制 ?ARE1 ?基因的表達，從而提高水稻的氮肥利用效率［70-71］。研究人員還發現，基因 ?OsNRT1.1A ?在 水稻中的過表達大大提高氮素利用率［72］。關于水稻氮高效基因的研究進展還有很多，比如 ?OsNPF7.3、 OsNPF7.7 ?基因的高表達可以提高水稻的氮素利用率［73-74］。日本研究人員對119份水稻進行轉錄組測序，在低氮條件下，鑒定出4個重要的轉錄調控因子 ?OsHHO3、OsHHO4、OsRLI1、OsbZIP11， ?是氮缺乏反應的關鍵調控因子，它們可能起到抑制轉錄因子的作用，從而提高水稻對氮素的利用率［75］。除了水稻，其他作物氮高效基因研究也在同時進行。范文靜通過對129份甘薯品種進行低氮和高氮處理，分析甘薯的11種農藝形狀并進行QTL定位和全基因組關聯分析，發現與氮高效利用相關的6個候選基因 ?itfo1go8120.t1、itf01g22030.t1、itf01g22080.t2、itf01g22100.t2、itf01g22400.t1、itf01g25900.t1 ?［76］。Gao等對氮高效甘蔗品種ROC22進行低氮處理，收集低氮處理后甘蔗根的miRNA數據庫，通過GO、KEGG分析，發現低氮處理下 ?miR156 ?的過表達顯著高于野生型，關鍵基因 ?NRT1.1、NR1、NIR1、GS的表達量也高于野生型，推測關鍵基因NRT1.1、NR1、NIR1、GS ?可能與氮高效利用有關［77］。在小麥的氮高效研究中，通過定點編輯基因 ?TaARE1 ?來提高小麥對土壤氮素的吸收［78］。作物氮高效的研究目前已取得顯著進展，但仍須繼續探索，以期為氮高效分子育種提供更多的候選基因位點，創制優異新品種。

7 展望

培育具有高氮素利用率和耐低氮的作物品種，是降低生產成本、降低碳排放量、緩解因過度施用氮素而帶來的生態問題的重要途徑。作物對氮的吸收與利用是一個復雜的過程。目前，對低氮環境下作物的氮高效利用和脅迫耐受的多分子協同調控機理的認識還不夠深入。未來的研究重點可以從以下3個方面展開：（1） 作物耐低氮和氮高效利用的分子機制和關鍵基因挖掘；（2） 通過基因編輯技術改良作物的低氮耐受能力，提高氮利用效率；（3） 低氮耐受和氮高效利用品種的開發與精確的田間管理和栽培技術相結合，最大限度地開發新品種的生物潛力。

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收 稿日期：2023-03-29

基金項目：國家糖料產業技術體系項目（編號：CARS-170102）；黑龍江省自然科學基金（編號：LH2023C090）；甜菜種質資源安全保存項目（編號：19230841）；甜菜種質資源精準鑒定項目（編號：19230709）；普查甜菜資源繁種編目入庫項目（編號：19230801）；黑龍江省普通本科高等學校青年創新人才培養計劃（編號：UNPYSCT-2020014）。

作者簡介：符晶晶（1999—），女，貴州銅仁人，碩士研究生，研究方向為農藝與種業。E-mail：1579776359@qq.com。

通信作者：劉大麗，博士，副研究員，研究方向為作物分子生物學。E-mail：daliliu_hlju@163.com。