超高壓預處理紫蘇蛋白與大豆蛋白復配蛋白肉的工藝條件優化

王丹　李河　周松華　李會珍　侯天宇

摘要：利用超高壓（ultra-high pressure，UHP）技術預處理紫蘇蛋白與大豆蛋白復配蛋白肉，并利用正交實驗探究其最佳工藝條件。采用UHP預處理技術，以紫蘇蛋白和大豆蛋白等質量比復配為主要原料，谷朊粉、淀粉、牛肉香精和魔芋膠等為輔料制備新型復合植物蛋白肉。采用單因素實驗和正交實驗考察水分添加量、魔芋膠添加量和UHP壓力對蛋白肉產品的咀嚼性、硬度、彈性、黏彈性、蒸煮和解凍特性的影響。復配蛋白肉的最佳工藝條件（以干基計）為水分添加量40%、魔芋膠添加量0.3%、UHP壓力500 MPa。在此工藝條件下所得的紫蘇蛋白復合肉與純大豆蛋白肉相比質構性能最佳，其咀嚼性高達46.993 J，比純大豆蛋白肉高近10倍，并且蒸煮和解凍損失率較低。該研究可為UHP的利用和紫蘇蛋白肉的工藝開發提供初步的科學思路，為植物蛋白肉的機制與工藝研究提供一定理論和技術支持。

關鍵詞：超高壓；紫蘇蛋白；大豆蛋白；蛋白肉；質構特性；工藝優化

中圖分類號：TS201.21文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2024）01-0018-07

肉類作為優質蛋白質和多種必需營養素的主要來源，在人類飲食結構中的占比不斷增加[1]。然而流行病學研究顯示，過量攝入肉類不僅會引發心血管疾病、炎癥性結腸炎等一系列慢性疾病，而且會造成牧場、飼料和水資源的大量消耗，引發人類對環境資源的擔憂[2]。植物蛋白肉具有零膽固醇、零激素、零反式脂肪酸、零抗生素、富含人體必需氨基酸等優點，開發植物蛋白肉可以兼顧人們對肉類食品味覺和飲食健康的需求[3-5]。

當前開發植物肉產品的植物蛋白原料主要以大豆蛋白、豌豆蛋白和花生蛋白等為主[6]，以紫蘇蛋白等小眾蛋白為原料的開發研究較少。紫蘇是山西常見的一種藥食同源植物，紫蘇籽榨油后的餅粕蛋白含量豐富。紫蘇蛋白不僅氨基酸比例全面，可以彌補動物蛋白中部分氨基酸不足的缺陷，而且沒有大豆蛋白所具有的豆腥味[7]，同時也未見任何關于其含有致敏因子的報道。因此，以紫蘇蛋白為原料制備的植物肉可能具有較高的營養價值和較大的市場空間[8-9]。

擠壓是目前植物基肉制品生產中最常見的加工工藝。根據原料水分含量的不同，可將擠壓技術分為低水分擠壓和高水分擠壓[10]。在原料方面，低水分擠壓的選擇范圍較寬，采用脫脂大豆粉、大豆濃縮蛋白和分離蛋白都可以得到植物基肉制品[11-12]。對高水分擠壓技術而言，當植物蛋白水分含量約為60%時具有較好的咀嚼性和口感。在原料方面，高水分擠壓的選擇較嚴格，只有蛋白含量在60%以上才能形成較好的纖維結構[13-14]。已有的產品也以低水分植物基肉制品為主，如火腿腸、辣條、豆干等。在設備方面，高水分植物基肉制品擠壓不僅需要雙螺桿擠壓機，而且對擠壓機的螺桿構型和長徑比等也有著較嚴格的要求。由于技術尚不夠成熟，消費者的接受程度低，其在我國市場上規模較小[12]。超高壓（ultra-high pressure，UHP）技術是一種新型非加熱的節能環保食品處理技術，其工作原理是以水為介質，利用超高水壓對軟包裝內的食品成分進行高壓擠壓處理（見圖1）[15]。近年來，對于UHP的應用多見于對果蔬、奶制品和肉禽類進行殺菌處理，以達到保鮮和延長貨架期的目的[16]。研究發現UHP可以通過破壞蛋白質非共價鍵來改變蛋白質的高級結構，進而改善蛋白質的一些功能性質，一定程度上可降低蛋白質的致敏性[17]，這一發現可為蛋白質的利用提供新途徑。因此，本研究利用超高壓技術，以紫蘇蛋白和大豆蛋白復配制備植物基蛋白肉，對影響蛋白肉品質和結構的水分添加量、魔芋膠添加量和UHP壓力進行探究，以期制備可有效減少大豆蛋白豆腥味和致敏因子的新型蛋白肉，為超高壓技術的利用和紫蘇蛋白肉的制備提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇蛋白（蛋白含量40%）：中北大學紫蘇課題組提供；大豆分離蛋白（蛋白含量90%）：河南萬邦化工科技有限公司；魔芋膠、谷朊粉、小麥淀粉（均為食品級）：河南萬邦實業有限公司；牛肉香精（食品級）：青島瑞香源食品有限公司；海天味極鮮特級醬油（食品級）：佛山市海天調味食品股份有限公司；魯花5S壓榨一級花生油（食品級）：山東魯花集團有限公司；苯酚（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；21種氨基酸標品（生物試劑）：上海麥克林生化科技有限公司；4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯（分析純）：上海凜恩科技發展有限公司；無水乙酸鈉（分析純）：天津石英鐘廠霸州市化工分廠；冰乙酸、硼酸、硼砂（均為分析純）：天津市恒興化學試劑制造有限公司；乙腈（色譜級）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HZK-FA210萬分之一精密電子天平 華志（福建）電子科技有限公司；SPP-10超高壓設備 山西力德?？萍加邢薰?；SMA TA質構儀 英國Stable Micro Systems公司；SJJ-E08G1和面機 小熊電器股份有限公司；BCD-576WDPU冰箱 海爾公司；GOLDTM C18色譜柱 海普瑞公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白肉的制備

將以干基計質量分數為30%的紫蘇蛋白與大豆蛋白按照1∶1的比例混合均勻，分別與質量分數為15%的谷朊粉、7%的淀粉、3%的牛肉香精和0.3%的魔芋膠混合，最后加入40%水、1.5%醬油和7%食用油；將混合物通過攪拌機斬拌均勻直至形成均一面糊狀，放入自封袋中于4 ℃冰箱過夜儲存；將自封袋內混合物在超高壓設備下進行高壓處理，在蒸鍋中蒸煮30 min并自然冷卻至室溫，封裝備用，其具體流程見圖1。

1.3.2 單因素實驗

經過多次預實驗對比對蛋白肉質構性能影響較大的因素后選取水分添加量、魔芋膠添加量、超高壓壓力進行單因素實驗考察，測定上述3個因素對蛋白肉蒸煮特性、解凍特性和質構特性的影響，確定最優工藝水平用于正交實驗。

1.3.2.1 水分添加量的確定

固定魔芋膠添加量為0.2%，超高壓壓力為550 MPa，參考金鑫[18]研究中的水分添加量，考察40%、50%和60%的水分添加量對蛋白肉品質的影響。

1.3.2.2 魔芋膠添加量的確定

固定水分添加量為40%，超高壓壓力為550 MPa，參考Zhang等[19]研究中的膠體添加量，考察0.1%、0.2%和0.3%的魔芋膠添加量對蛋白肉品質的影響。

1.3.2.3 超高壓壓力的確定

固定水分添加量為40%，魔芋膠添加量為0.2%，考察超高壓壓力500，550，600 MPa對蛋白肉品質的影響。

1.3.3 正交實驗的設計

為了優化實驗配方，結合單因素實驗的結果，設計三因素三水平正交實驗，考察水分添加量、魔芋膠添加量和超高壓壓力對蛋白肉品質和性能影響的最適條件。以咀嚼性、蒸煮損失率和解凍損失率為蛋白肉的評估標準，其中以咀嚼性為主要衡量標準，正交實驗因素水平表見表1。

1.3.4 紫蘇蛋白-大豆蛋白復合肉的品質性能評定方法

1.3.4.1 蛋白肉蒸煮損失率的測定方法

稱量超高壓擠壓后的蛋白肉質量，蒸煮30 min后冷卻至室溫并再次稱重。蒸煮損失率的計算公式見式（1）：

蒸煮損失率（%）=（蒸煮前蛋白肉質量－蒸煮后蛋白肉質量）/蒸煮前蛋白肉質量×100%。（1）

1.3.4.2 蛋白肉解凍損失率的測定方法

將冷卻至室溫的蛋白肉于-18 ℃冷凍24 h后取出，在4 ℃冰箱內解凍24 h。擦拭吸附在蛋白肉表面的滲出物，稱量解凍后的蛋白肉質量。解凍損失率的計算公式見式（2）：

ω=[（m0-mi）/m0]×100%。（2）

式中：ω為解凍損失率，%；m0和mi分別為解凍前、后蛋白肉的質量，g。

1.3.4.3 蛋白肉質構特性的測定方法

將蒸煮后冷卻至室溫的蛋白肉切成大小一致的小塊，采用質構儀對蛋白肉進行全質構測定。以P50探頭進行測試，觸發力5 g，下壓程度50%，測試前、后速度均為2 mm/s，測試速度為1 mm/s，兩次下壓中間間隔3 s。最終以咀嚼性為蛋白肉質構的評分指標。

1.3.4.4 蛋白肉氨基酸組成的測定

a.標準品及樣品衍生化

準確稱量21種氨基酸標準品，分別制備成1 mg/mL的貯備液。各樣品以6 mol/L HCl為溶劑配制成1 mg/mL樣品溶液，加入苯酚1～2滴并通入氮氣，在110 ℃油浴中消解24 h后迅速冰水浴冷卻至室溫，并使用NaOH中和消解液。用pH 9.0的硼酸緩沖液稀釋標品和樣品溶液，加入衍生劑4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯于60 ℃水浴衍生化30 min，過0.22 μm水系膜，于4 ℃冰箱中貯存待測。

b.色譜條件

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對樣品的氨基酸進行測定，色譜條件：Hypersil GOLDTM C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；流速0.28 mL/min；檢測波長240 nm；流動相：A相為乙腈，B相為pH 5.65～5.70的乙酸鈉緩沖液，梯度洗脫，洗脫條件見表2。

1.4 數據處理

使用Excel 2010和IBM SPSS Statistics 24對所有實驗數據進行預處理和方差顯著性分析。之后采用Origin 2018和GraphPad Prism 9進一步進行數據分析和作圖，所有實驗均不少于3次重復。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 水分添加量對蛋白肉品質的影響

食品質構包括硬度、彈力、回彈力、內聚性、黏彈性和咀嚼性等特性，并且各參數之間有著一定的關聯。一般來說，具有代表性的如咀嚼性=硬度×內聚性×彈性，所以本研究選用咀嚼性為衡量蛋白肉性能的標準之一[20]。

由圖2中A可知，當水分添加量為40%～60%時，蛋白肉的咀嚼性呈現先升高后降低的趨勢，在水分添加量為50%時咀嚼性達到最大值[21]。當物料水分低于40%時，蛋白無法通過擠壓形成纖維結構并且由于水分含量偏低，擠出物質地偏硬[22]。隨著水分含量的增加，蛋白與蛋白之間、蛋白與水之間的相互作用愈發劇烈，從而使得疏水基團被暴露，混合物在經UHP擠壓后部分水分被擠出[23]。這可能是蛋白肉在水分添加量為50%時咀嚼性和硬度都達到最大值的主要原因。蒸煮和解凍損失是指干物質通過高溫蒸煮和解凍溫差所揮發和水解流失掉的重量[24]。由圖2中B可知蒸煮和解凍損失率與水分添加量的關系，隨著水分添加量的不斷增加，蒸煮損失率降低。這可能是隨著水分添加量的增加，蛋白質結構疏松，持水性增強導致的。而解凍損失率呈現先降低后升高的趨勢，且在水分添加量為50%時最低。說明適當的水分能夠提高蛋白與蛋白之間更牢固的疏水和親水相互作用[25]。而當水分添加量進一步增加時，過多的水分會在解凍時極易流失，導致蛋白肉的解凍損失率增加，進一步致使蛋白肉的質構和功能特性降低。

由表3可知，隨著水分添加量的增加，蛋白肉的彈性逐漸增大，內聚性逐漸降低，這可能是由于水分的增加使得蛋白肉的內部結構疏松，從而使得產品的回復能力增強而彈性變大，內聚性降低[26]。

2.1.2 魔芋膠添加量對蛋白肉品質的影響

由圖3中A可知，蛋白肉的最佳魔芋膠添加量為0.2%，在此條件下蛋白肉的咀嚼性達到最大值。魔芋膠添加量從0.1%增至0.2%時，其對蛋白肉咀嚼性的影響較大，而隨著魔芋膠添加量的進一步增加，其對咀嚼性的影響降低，說明在魔芋膠添加量較低時，魔芋膠對蛋白肉質構的影響較大。

魔芋膠具有帶負電荷的硫醇和羧基基團，能夠通過氫鍵相互作用提高水分的結合，進一步提高蛋白質的黏稠度，從而減少蒸煮損失。由圖3中B可知，蛋白肉的蒸煮和解凍損失率都隨著魔芋膠添加量的增加先升高后降低，魔芋膠添加量從0.2%增加到0.3%的過程中，蛋白肉的蒸煮和解凍損失率都顯著降低（P<0.05）。

由表4可知，當魔芋膠添加量為0.2%時，蛋白肉的硬度和彈性都達到最大值，而內聚性和黏彈性則隨著魔芋膠添加量的增加先降低后緩慢升高。杜潔晨[27]的研究同樣發現，隨著魔芋膠添加量的增加，素肉香腸的彈性呈現先顯著上升后趨于穩定的趨勢。這可能是由于魔芋膠較緊密的凝膠網絡結構使得產品的彈性升高，從而咀嚼性較好。Palanisamy等[28]在制備蛋白肉時添加卡拉膠的研究中也有類似的報道。

2.1.3 超高壓壓力對蛋白肉品質的影響

蛋白質在超高壓預處理后其二、三級結構會發生變化，并且隨著壓力的增加和時間的增長，蛋白質經超高壓釋放出來的疏水結構會重新被包埋，不利于蛋白質的加工特性[29]。通過預實驗，本研究確定超高壓時間為8 min，設定壓力為500～600 MPa。由圖4中A可知，隨著壓力的增大，復合蛋白肉的咀嚼性先升高后降低，并且升高趨勢和降低趨勢都十分顯著，在壓力為550 MPa時咀嚼性達到最大值。由圖4中B可知，隨著壓力逐漸增大，解凍損失率先降低后升高，并在550 MPa時損失率最低，與咀嚼性最優的超高壓壓力條件一致。而蒸煮損失率隨著壓力的增大呈現先升高后降低的趨勢，并且在550 MPa時蒸煮損失率最高，這與Rodiles-López等[30]的研究結果相似，在超高壓壓力為600 MPa時，牛泌乳蛋白的溶解性得到提高。而蛋白質的溶解度提高會使淀粉等非水分物質被進一步溶解，進而在蛋白肉蒸煮過程中通過水分揮發而流失。

由表5可知，隨著UHP壓力的逐漸增大，硬度先增大后減小，并且在550 MPa時達到最大值。壓力增大造成硬度和咀嚼性下降的原因可能是：壓力增加導致形成了大分子聚集物，這些聚集體嵌入蛋白疏水基團和巰基，減少了蛋白質之間的相互作用，導致蛋白肉的硬度降低，咀嚼性減小[31]。同時，由于質構中硬度與內聚性和彈性之間具有線性關系，所以蛋白肉的其他質構特性均與硬度呈現相似的變化趨勢，進一步說明超高壓對蛋白肉結構的影響較大[32]。

2.2 正交實驗

由表6可知，最優的實驗方案為A1B3C1，并且各因素對蛋白肉品質的影響程度為C>B>A，即UHP壓力的影響最大，其次是魔芋膠添加量，最后是水分添加量。所以最適條件為水分添加量40%、魔芋膠添加量0.3%和UHP壓力500 MPa。對咀嚼性進行方差分析，見表7。

由表7可知，UHP壓力的F值高達12.270 2，并且P值為0.000 2，說明UHP壓力對蛋白肉的咀嚼性有極顯著影響，而水分和魔芋膠添加量對咀嚼性的影響較小。

由表8可知，以蒸煮和解凍損失率為指標，各因素的最佳方案均是A1B3C1，即水分添加量40%、魔芋膠添加量0.3%和超高壓壓力500 MPa。對兩種指標進行方差分析，結果見表9和表10。

由表9和表10可知，3個因素對蛋白肉蒸煮特性的影響不顯著，水分添加量對解凍特性的影響較顯著。結合咀嚼性正交實驗結果，綜合考慮蛋白肉總體質構和性能，最終選擇最優方案為A1B3C1。

2.3 驗證性實驗

由正交實驗所得的最適工藝條件水分添加量40%、魔芋膠添加量0.3%和超高壓壓力500 MPa制備紫蘇蛋白復合肉和純大豆蛋白肉。

紫蘇蛋白復合肉較純大豆蛋白肉顏色更深，更接近熟肉產品的色澤，并且紋理更清晰。對此條件下兩種蛋白肉的質構特性進行對比發現紫蘇蛋白復合肉的所有質構特性都顯著高于純大豆蛋白肉（P<0.05），其中咀嚼性高達46.993 J，是純大豆蛋白肉的11.5倍左右，見表11。

由表12可知兩種蛋白肉蒸煮和解凍損失率的對比結果，發現紫蘇蛋白復合肉的蒸煮和解凍損失率最低（P<0.05）。

2.4 蛋白肉氨基酸組成分析

由表12可知，兩種蛋白肉的氨基酸種類相似且齊全，而且除紫蘇蛋白復合肉的組氨酸和蛋氨酸含量與純大豆蛋白肉相差不大外，其余均顯著增加（P<0.05）。并且可以看出在所有氨基酸種類中鮮味氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）的占比較大，說明紫蘇蛋白復合肉可能比純大豆蛋白肉的呈味效果更好，在一定程度上可以降低大豆蛋白帶來的豆腥味。

3 結論

本研究采用UHP技術制作紫蘇蛋白復合肉，通過實驗發現UHP壓力對蛋白肉的品質和性能有極顯著影響，相較之下，水分添加量、魔芋膠添加量的影響較小。通過單因素實驗和正交實驗的綜合分析，最優實驗條件為水分添加量40%、魔芋膠添加量0.3%、超高壓壓力500 MPa。在此條件下所得紫蘇蛋白復合肉的咀嚼性較純大豆蛋白肉高，達46.993 J，蒸煮和解凍特性與純大豆蛋白肉相比顯著降低。將紫蘇蛋白與大豆蛋白進行混合復配，既豐富了蛋白肉的氨基酸組成，提高了蛋白肉的呈味效果，又可能降低大豆蛋白的豆腥味。同時UHP可能會一定程度減輕致敏性，為UHP的利用和紫蘇蛋白肉的工藝開發提供了初步的科學思路和依據。關于UHP改變蛋白結構（紫蘇蛋白和大豆蛋白）及結合高水分擠壓技術的植物肉工藝需要未來進一步對比和探究。

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