L-酪氨酸連續發酵工藝研究

王銳麒　劉韙瑋　趙春光　徐慶陽

摘要：當前工業上用微生物發酵法生產L-酪氨酸的工藝中，基本都是前期向發酵罐內加入基礎培養基，中后期再流加各類營養物質，雖然整個發酵過程中減少了取料和放料的操作，保證發酵中物料不被浪費，但是，隨著流加物質的不斷增加，發酵液體系不斷擴大，該過程在發酵后期需要不斷地人為調控發酵參數，而人為調控中，難以避免調控參數波動，并最終影響發酵結果。因此，實驗采用高效連續發酵，該工藝可以大大提高菌體活力，并且有效延長產酸高峰期，為了優化L-酪氨酸的高密度連續發酵生產工藝，通過對大腸桿菌TYR-05發酵培養，考察了L-酪氨酸發酵過程并且分析了菌體量、產酸量、產酸效率、糖酸轉化率的情況，確定L-酪氨酸高密度連續發酵過程中接種量、糖速率、糖耗量、底糖濃度等關鍵條件，以達到高密度連續發酵工藝控制條件優化。實驗結果表明在5 L發酵罐中，選擇30%的種子接種量，發酵起始時，底物氯化膽堿濃度為1 g/L并每4 h向罐內流加0.2 g/L的氯化膽堿，發酵至12 h時，底糖耗盡，開始以12 g/（L·h）的補糖速率向罐內提供葡萄糖，并在此時開始放液，放液速率為0.13 L/h，使得裝液量恒定在20%左右，發酵25 h時開始流加復合營養液，發酵35 h時最高菌體OD600達到65，產酸量為55.8 g/L，糖酸轉化率為25.4%，為L-酪氨酸連續發酵工業化生產提供了重要參考。

關鍵詞：L-酪氨酸；連續發酵工藝；大腸桿菌；糖酸轉化率；補糖速率

中圖分類號：TS201.1文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2024）01-0107-06

Study on Continuous Fermentation Technology of L-Tyrosine

WANG Rui-qiLIU Wei-weiZHAO Chun-guangXU Qing-yang1，3，4*

Abstract：? In the current industrial process of producing L-tyrosine by microbial fermentation method， the basic culture medium is generally added into the fermentation tank in the early stage， and then various nutrients are fed in the middle and later stages. Although in the entire fermentation process， the operations of taking and releasing materials are reduced， ensuring that materials are not wasted during the fermentation， with the continuous increase of fed-in materials， the fermentation liquid system continues to expand. The fermentation parameters need to be continuously regulated and controlled artificially in the later stage of fermentation.However， it is difficult to avoid the fluctuation of the regulation parameters in the artificial regulation and control， and eventually affecting the fermentation results. Therefore， efficient continuous fermentation is adopted in this experiment， which can greatly improve the cell vitality and effectively prolong the peak period of acid production. In order to optimize the high-density continuous fermentation production process of L-tyrosine， the fermentation process of L-tyrosine is investigated through the fermentation culture of E. coli TYR-05， and the biomass， acid productionamount， acid production efficiency and sugar-acid conversion rate are analyzed. Key conditions such as inoculation amount， sugar rate， sugar consumption amount and base sugar concentration are determined during the high-density continuous fermentation process of L-tyrosine， in order to achieve the optimization of the control conditions for the high-density continuous fermentation process. The experimental results show that in a 5 L fermentation tank， 30% seed inoculation amount is selected. At the beginning of fermentation， the substrate choline chloride concentration is 1 g/L， and 0.2 g/L choline chloride is fed into the tank every 4 h. After 12 h of fermentation， the base sugar is depleted， and glucose is supplied into the tank at a sugar supplement rate of 12 g/（L·h）. At this time， the liquid is released at a rate of 0.13 L/h to make the liquid volume constant at about 20%. After 25 h of fermentation， compound nutrient liquid is fed in. After 35 h of fermentation， the highest cell OD600 reaches 65， the acid production amount is 55.8 g/L， and the sugar-acid conversion rate is 25.4%， which has provided important references for the industrial production of L-tyrosine continuous fermentation.

Key words： L-tyrosine; continuous fermentation process; Escherichia coli; sugar-acid conversion rate; sugar supplement rate

L-酪氨酸是一種芳香族氨基酸，在人體中起著重要作用[1]，其在食品、飼料、醫藥和化工行業中有著廣泛的應用。酪氨酸在調節情緒、刺激神經系統的同時，還可以加速新陳代謝、緩解疲勞[2]。因此，人體需要其產生許多關鍵的物質，以便于幫助調節食欲和人體對壓力的反應。酪氨酸也是重要的食品添加劑之一，已在乳類、肉類、飼料等食品方面得到廣泛的應用[3]。

L-酪氨酸的生產方法目前有4種，分別是蛋白質水解物提取法、化學合成法、酶法和微生物發酵法[4]。蛋白質水解物提取法是比較傳統的生產方法，該方法在工業中存在原料成本高、工藝復雜、周期漫長、收取率低等問題，并且對環境污染較大[5]?；瘜W合成法生產酪氨酸主要得到的是DL-酪氨酸，從DL-酪氨酸到L-酪氨酸需要進一步拆分，工藝繁瑣、能耗大，不適用于工業化生產。酶法生產酪氨酸雖然方法簡單、反應溫和、收取率高，但是其生產中酶的活性不易控制，會受到前體物質的抑制[6]。而微生物發酵法生產酪氨酸是目前主要的生產方法，該方法原材料廉價，在合適的發酵條件下，菌株經過發酵可直接獲得L-酪氨酸，且發酵成本低，原料易獲得，反應所需能耗小，對環境沒有很大的污染[7]。

微生物發酵法生產L-酪氨酸根據生產菌種、原料、裝置特征、技術可行性等方面可以選擇不同的發酵方式[8]，常見的發酵方式有好氧/厭氧發酵、液體/固體發酵、分批發酵、補料發酵、連續發酵。本文根據L-酪氨酸的特性，選擇菌種的高效連續發酵，該方法菌種活力好、產酸效率高。

大腸桿菌因為生長速率快、易于培養且生產L-酪氨酸有優勢，成為發酵法生產L-酪氨酸的主要微生物，是目前工業生產中理想的菌株之一[9]。雖然眾多科研人員開展了微生物發酵法生產L-酪氨酸的研究，但發酵技術仍然不成熟。針對發酵過程中生物量低、生產速率低、糖酸轉化率低等問題，本文通過對大腸桿菌連續發酵生產L-酪氨酸各參數條件進行實驗分析，達到提高L-酪氨酸的產量和糖酸轉化率的目的，以期為L-酪氨酸的工業化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-酪氨酸生產菌：大腸桿菌TYR-05（PT7-aroGfbr+PT7-tyrAfbrtyrB+PxylF-T7RNAP+ApheLA），天津科技大學代謝工程研究室保藏。

1.2 培養基

1.2.1 種子培養基

葡萄糖25 g/L;酵母粉4 g/L；檸檬酸鹽2 g/L；（NH4）2SO4·7H2O 2.5 g/L；KH2PO4·3H2O 3 g/L；MgSO4·7H2O 2 g/L；FeSO4·7H2O 5 mg/L；MnSO4·7H2O 1 mg/L；VH 0.5 mg/L；VB混0.5 mg/L;微量元素混合液1 mL/L。

1.2.2 發酵培養基

葡萄糖20 g/L；酵母粉4 g/L;（NH4）2SO4 3 g/L；KH2PO4·3H2O 3 g/L，檸檬酸鹽1.8 g/L;蛋氨酸1 g/L；苯丙氨酸0.8 g/L;FeSO4·7H2O 30 mg/L;MnSO4·H2O 10 mg/L;VH 1 mg/L；VB混0.5 mg/L；微量元素混合液1.5 mL/L。

1.3 主要儀器

Biotech-100KBS發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；SBA-40ES生物傳感儀 濟南延和生物科技有限公司；BT-4電子天平 深圳博途電子科技有限公司；75UV分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；Olympus生物顯微鏡 日本Olympus株式會社；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；Agilent 1200高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；氨基酸專用C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，No.20200031） 大連依利特分析儀器有限公司。

1.4 培養方法

1.4.1 菌種活化

從－80 ℃冰箱中取出菌株，在超凈臺中于酒精燈火焰旁用接種環取3環于試管斜面上，于32 ℃培養箱中培養12～14 h。

1.4.2 一級種子培養

待菌種活化好后，在超凈臺中于酒精燈火焰旁用接種環取3環于茄形瓶斜面培養基上，于32 ℃培養箱中過夜培養。

1.4.3 二級種子培養

待一級種子活化好后，用滅過菌的洗菌水在超凈臺清洗菌體，將洗好的菌液在發酵罐補料口于火焰旁倒入發酵罐中，控制罐內發酵溫度為36 ℃，在pH 7.0環境下培養。

1.4.4 發酵培養

當菌體量OD600達到要求時，按相應要求的接種量放液，同時加入發酵培養基于發酵罐中，加入底糖，流加調控氨水來調節pH，使pH維持在7.0～7.2，調節攪拌軸控制罐內溶氧，調節通風控制罐壓，使罐壓維持在0.0 發酵溫度36 ℃，發酵周期35 h。

1.5 實驗方法

在發酵培養基中加入底糖，接種完后將發酵液體系定容到發酵罐體積的20%左右開始發酵，當罐內殘糖耗盡或其含量為0.1 g/L時對其進行流加補糖，控制流加速率，維持罐內殘糖濃度，使其濃度≤0.1 g/L，同時控制泵出速率與補糖速率的動態平衡，使得泵出體積與補料體積一樣，以保持罐內體積穩定。連續發酵工藝布局圖見圖1。

1.5.1 L-酪氨酸高效連續發酵接種量的確定

為了確定連續發酵最適生物接種量，對不同接種量下菌體量OD600的生長情況和產酸量的關系進行測定。分別采用接種量15%、20%、25%、30%進行發酵，分析不同接種比例對菌體OD和L-酪氨酸產量的影響，并確定最適接種量。

1.5.2 L-酪氨酸高效連續發酵底糖濃度和補糖濃度的確定

為了確定連續發酵最適發酵底糖濃度和補糖濃度，在最適接種量的條件下發酵，每4 h記錄每升發酵液所消耗糖量，經計算得出最適底糖濃度，依據平均耗糖速率計算得出補糖濃度。

1.5.3 L-酪氨酸高效連續發酵底物氯化膽堿濃度和添加時間的確定

為了確定高效連續發酵底物中氯化膽堿的最適添加量，分別向底物中添加0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的氯化膽堿，于三角瓶中進行搖瓶發酵，并分析不同濃度對產量和轉化率的影響。為了確定流加氯化膽堿的添加濃度和添加時間，選擇在0， 8，12，16，20 h分別流加0，0.1，0.2，0.3，0. 0.5 g/L的氯化膽堿，確定最佳的流加工藝。

1.5.4 L-酪氨酸高效連續發酵流加補料的確定

為了確定連續高效發酵流加補料的效果，在初步確定好連續發酵L-酪氨酸的各個成分濃度后，在發酵菌體衰退期加入復合營養液，分析流加營養液后菌體OD、耗糖量、產量的變化，確定流加復合營養液對連續高效發酵的時間。

1.6 發酵檢測方法

1.6.1 發酵過程中pH的測定

發酵罐內的pH用罐自帶的pH電極測定，精密pH試紙輔助測定。

1.6.2 發酵過程中殘糖的測定

罐中取樣，用離心機離心留上清液，將上清液稀釋100倍，用SBA-40ES生物傳感儀測定殘糖含量。

1.6.3 發酵過程中菌體量的測定

每2 h從發酵罐中取樣，吸取原樣稀釋相應倍數，用75UV分光光度計測定菌體量，菌體量可用吸光度OD600表示，其計算方式為菌體量=OD600×稀釋倍數。

1.6.4 發酵過程中L-酪氨酸的測定

發酵開始，每2 h取樣，用離心機離心留上清液，取上清液稀釋100，200，300等相應倍數，再用SBA-40ES生物傳感分析儀測定酪氨酸產量。

2 結果與討論

2.1 L-酪氨酸高效連續發酵接種量的確定

由于不同接種量會影響菌體生長情況，進而很大程度影響L-酪氨酸的產量，且接種量與發酵前期生長速度和開始產酸高峰期的時間息息相關[10]，因此，本實驗為了確定最適接種量，設計不同接種量進行發酵，并測定在不同接種量下菌體量OD600和產酸的情況。實驗組分別為A（15%）、B（20%）、C（25%）、D（30%）。

由圖2可知，在接種量為30%時，菌體生長快，產酸速率高，最大OD600為35，較其他實驗組分別提高了18.1%、33.2%、41.3%，最大產酸量為42.4 g/L，較其他實驗組分別提高了13.8%、19.6%、32.2%。在發酵25 h后，所有實驗組菌體量都有所下降，產酸速率也變得緩慢，在最適接種量的前提下，發酵后期對其他方式進行優化，以達到增強菌體活力、提高產物生成速率的目的[11]。因此，本實驗為了在發酵前期獲得較高的菌體量和菌體活力，選擇接種量為30%的實驗組進行連續發酵工藝的研究。

2.2 L-酪氨酸高效連續發酵底糖濃度和補糖濃度的確定

在確定好合適的接種量的條件下，選擇合適的底糖濃度和補糖濃度以及補糖時間，對發酵產物產量和產酸速率有著重要影響[12]。底糖濃度決定著發酵在哪個階段才能開始補糖，由于本實驗要求在補料的同時放出相同體積的發酵液以維持罐內發酵體系的穩定，并且使罐內殘糖維持在一定的濃度水平，因此，需選擇一個最適補糖速率，才能使得罐內殘糖處于穩定水平。在接種量30%的水平上研究發現，當發酵進行到12 h時，L-酪氨酸合成速率開始緩慢下降，因此選擇在12 h進行補料并且開始放液。

由圖3可知，每2 h測定每升發酵液的耗糖量，經計算得知，發酵12 h時總消耗糖量為24 g/L，因此罐內底糖濃度為24 g/L。在發酵8～12 h的時間段，發酵平均耗糖速率為12 g/（L·h），因此，想要維持L-酪氨酸的高產酸率，必須向罐內提供的底糖濃度為24 g/L，補糖速率至少維持在12 g/L。在5 L發酵罐中，由于罐內發酵體系體積為罐的30%，即1.5 L的發酵液，若要使發酵體系維持在恒定的水平，防止發酵液體系變大對產量的影響，經計算，需保持0.13 L/h的發酵液放液速率。

2.3 L-酪氨酸高效連續發酵底物氯化膽堿濃度和添加時間的確定

在L-酪氨酸的發酵過程中，生長因子作為必不可少的營養物質，其在微生物體內的主要作用為促進細胞生長、增強酶活及產物代謝等。而在L-酪氨酸連續發酵實驗中，最關鍵的生長因子之一為氯化膽堿，氯化膽堿可以促進細胞膜的合成。蛋氨酸、葉酸等可以在細胞內提供不穩定的甲基，促進菌體生長代謝，氯化膽堿也可以提供不穩定的甲基。微生物利用維生素B12和葉酸作為輔酶，通過絲氨酸和蛋氨酸合成膽堿，故在底物中流加氯化膽堿可以提供活性甲基，促進菌體生長，從而提高L-酪氨酸的產量和糖酸轉化率。

為了明確底物氯化膽堿的最適添加量，分別向底物中添加0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的氯化膽堿，于三角瓶中進行搖瓶發酵，期間用氨水調節pH至7.0～7.2，發酵35 h，結果見圖4。

由圖4可知，當底物中氯化膽堿添加量不同時，其對L-酪氨酸產量的促進作用差別較大。當底物中氯化膽堿濃度為0～2.5 g/L時，L-酪氨酸的產量隨著底物添加量的增加而提高。當底物濃度為2.0 g/L時，L-酪氨酸的產量最高，達到15 g/L。當底物濃度超過1.0 g/L時，糖酸轉化率達到峰值，隨著氯化膽堿濃度的增加，L-酪氨酸的產量不再增加，但糖酸轉化率降低，可能是搖瓶內溶氧不夠導致的，從而影響了L-酪氨酸的產量。因而，從節省成本、綜合產酸和轉化率等方面考慮，發酵底物中氯化膽堿最適添加濃度為1.0 g/L。

由于在底物培養基中不同添加量的氯化膽堿對L-酪氨酸產量的促進作用有著明顯的差異，因此考察了不同發酵時間流加氯化膽堿對L-酪氨酸發酵的影響。在搖瓶發酵實驗中，通過10%氨水調節pH至7.0～7.2，發酵35 h時結束。根據經驗，選擇發酵前期和中期進行流加，故本實驗選擇在0， 8，12，16，20 h分別流加0，0.1，0.2，0.3，0. 0.5 g/L的氯化膽堿，發酵過程中L-酪氨酸產量和糖酸轉化率結果見圖5。

由圖5可知，在不同的發酵時間段，底物中流加氯化膽堿的量不同，對L-酪氨酸產量的促進作用有一定差異。在發酵過程中流加0.2 g/L的氯化膽堿，L-酪氨酸產量和糖酸轉化率達到最大值，隨著流加氯化膽堿濃度的增加，搖瓶內溶氧不足，產量保持不變。因而，選擇在發酵過程中0， 8，12，16，20 h分別流加0.2 g/L氯化膽堿，效果最好。

2.4 L-酪氨酸高效連續發酵流加補料的確定

前期實驗中，初步得出高效連續發酵工藝發酵所需基本條件：發酵底糖濃度24 g/L，發酵12 h后開始補加糖，其補加速率至少維持在12 g/（L·h），底物氯化膽堿添加量為1 g/L，發酵過程中0， 8，12，16，20 h分別流加0.2 g/L氯化膽堿，發酵放液速率為0.13 L/h左右。根據上述參數進行控制實驗，結果見圖6。在12 h后開始補糖，菌體的活力依舊很高，菌體OD值小幅度增長，罐內體積維持在穩定水平，但發酵25 h后，菌體活力開始下降，產酸和糖耗量開始降低，發酵28 h時，測得罐內L-酪氨酸的濃度為48.1 g/L，說明菌體活力明顯下降。

由圖6可知，通過連續發酵，可使L-酪氨酸產酸高峰期從16 h延長至25 h，如果在發酵25 h后添加培養基相似成分的復合營養液，可有效延長菌體的活力以及產酸高峰期[13-14]。

由圖7可知，在補加復合營養液發酵25 h后，菌體量、產酸速率依舊維持在較高水平，直到發酵35 h后，菌體OD值和產酸量開始緩慢下降，發酵35 h時測得L-酪氨酸產量降至52.4 g/L，由此停止發酵?？梢娫诟咝нB續發酵工藝中，發酵后期補與加培養基相似的復合營養液，有利于緩解菌體衰退，維持菌體生長代謝的活力[15-16]。

2.5 高效連續發酵生產工藝中L-酪氨酸產量及糖酸轉化率

本實驗中，核算各個數據，見表1。發酵35 h時，連續發酵的L-酪氨酸產量約為55.8 g/L，累計耗糖量為990 g，糖酸轉化率約為25.5%，相對于普通發酵的糖酸轉化率提高了28.1%。單批次發酵L-酪氨酸的產量達到247.5 g，相較于普通發酵產量126.4 g，總產量提高了49.1%；整個發酵工藝中，L-酪氨酸的平均產酸量為7.1 g/h，相較于普通發酵的3.6 g/h，產酸量提高了約49.2%。由此可知，該工藝中，菌體活力好、生長旺盛、耗糖快、產酸多，因而導致糖酸轉化率高于一般發酵法[17-18]。因此，高效連續發酵工藝可以有效地提高L-酪氨酸的產量和糖酸轉化率[19]。

3 結論

L-酪氨酸是重要的食品添加劑，具有治療抑郁癥、舒緩壓力等功能，因此受到廣泛的關注和應用，微生物連續發酵法生產L-酪氨酸具有廣闊的研究前景。

在L-酪氨酸高效連續發酵工藝研究中，其產酸量和糖酸轉化率是發酵控制的基本指標，本研究通過單因素實驗確定最適接種量為30%，底糖濃度為12 g/L，補糖速率為12 g/（L·h），放料速率為0.13 L/h，底物氯化膽堿添加量為1 g/L，并在發酵過程中0， 8，12，16，20 h分別流加0.2 g/L氯化膽堿。實驗表明，在高接種量的前提下，該發酵方法使得菌體能快速進入產酸期，由于在補加糖和營養物的同時以相同放料速率放出發酵液，使得罐內體系維持平衡，且菌體活力很好，使得產酸周期延長至35 h，較普通發酵提高了30.3%，單批次發酵L-酪氨酸產量為247.5 g，較普通發酵提高了49.1%，糖酸轉率提高了49.2%，可見連續發酵能夠有效提高L-酪氨酸發酵的產量及糖酸轉化率，具有很大的工業生產研究潛力。

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收稿日期：2023-08-16

基金項目：寧夏回族自治區重點研發計劃（2021BDE92007）;山東省重點研發計劃（2021ZDSYS10）

作者簡介：王銳麒（1998－），男，碩士研究生，研究方向：代謝工程及發酵過程控制。

*通信作者：徐慶陽（1980－），男，副研究員，博士，研究方向：代謝工程及發酵過程控制。