微生物合成血紅蛋白的研究進展及其在食品中的應用

王慶沛　宇光?！×螑勖馈∨她垺↑S繼紅

摘要：血紅蛋白是存在于原核和真核細胞中由血紅素輔基和珠蛋白肽鏈構成的血紅素蛋白，具有多種生理功能，常被用于醫藥與食品行業。在食品加工領域，其作為調味劑以提高代肉未來食品——植物蛋白肉的口感和擬真性可以滿足有特殊營養要求的人們對肉類口感的需求。利用微生物發酵法生產血紅蛋白相較于化學法提取具有操作方便、經濟高效、環境友好等優勢，近幾年已經成為研究的熱點。微生物高效表達血紅蛋白的關鍵在于血紅素的高水平供應與血紅蛋白的正確表達兩個方面，強化血紅素合成途徑、優化蛋白表達和發酵策略是實現血紅蛋白高效表達的重要途徑。文章圍繞微生物高效合成血紅蛋白最新研究進展、血紅蛋白及其衍生物在食品中的應用開展綜述，以期為促進微生物源血紅蛋白在食品中的應用提供理論參考。

關鍵詞：血紅蛋白；血紅素；植物蛋白肉；未來食品；食品調味品

中圖分類號：TS201.1文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2024）01-0189-09

Research Progress of Synthesis of Hemoglobin by Microorganisms and Its Application in Food

WANG Qing-peiYU Guang-haiLIAO Ai-meiPAN LongHUANG Ji-hong1， 4*

Abstract： Hemoglobin is a heme protein composed of heme subunits and globin peptide chains that exists in prokaryotic and eukaryotic cells. It has various physiological functions and is often used in the pharmaceutical and food industries. In the field of food processing， it can be used as a seasoning agent to improve the taste and authenticity of future meat substitutes — plant protein meat， so as to meet the needs of people with special nutritional requirements for meat taste. Using microbial fermentation method to produce hemoglobin has advantages compared with chemical method， it is easy to operate， economical， efficient and environmentally friendly， and has become a research hotspot in recent years. The key to efficient expression of hemoglobin by microorganisms lies in two aspects： the high-level supply of hemoglobin and the correct expression of hemoglobin. Strengthening the heme synthesis? pathway， optimizing protein expression and fermentation strategies are important ways to achieve? efficient expression of hemoglobin. In this paper， the latest research progress of the efficient synthesis of hemoglobin by microorganisms， as well as the application of hemoglobin and its derivatives in food are reviewed， in order to provide theoretical references for promoting the application of microbial derived hemoglobin in food.

Key words： hemoglobin; heme; vegetable protein meat; future food; food seasoning

隨著消費水平的提高，人們對肉類食品的需求逐年增加，且受動物疫病[1]、生產周期[2]、氣候變化[3]等因素的影響，傳統的畜牧養殖業生產的肉類已無法滿足人們的需要，養殖過程中產生的能耗與溫室氣體的排放也會對環境造成嚴重的負擔[4]。且傳統養殖肉導致人類“三高”患病率逐年增加，尋求一類既能滿足人們對養殖肉營養元素的需要，又能減少患病率的代肉未來食品已成為科研人員研究的方向[5]。目前代肉食品主要分為兩種：一種是以大豆等植物蛋白為原料的植物蛋白肉，另一種是從動物身上提取細胞組織培育成的細胞培養肉[6]。

細胞培養肉生產成本較高，無法實現規?；a，因此目前代肉食品的研究主要集中在植物基代肉未來食品。且由于食品加工業的快速發展和健康飲食知識的滲透，民眾的飲食要求已從之前的“吃得飽、吃得好”轉變為“吃得安全、吃得營養”。植物蛋白肉作為未來食品產業發展的主要研究方向，不僅可以減少畜牧業對水和土地的需求，降低溫室氣體的排放量[7]，而且能為對健康有特殊要求的消費者提供更多的選擇。與真肉相比，植物蛋白肉具有豐富的植物蛋白，能降低心血管疾病和Ⅱ型糖尿病的患病風險[8]。

植物基蛋白肉是通過擠壓技術和3D食品打印技術將植物蛋白加工成類似肉類的纖維結構，從而模擬真肉的質地與口感。雖然制造技術已經相當成熟，但是在色澤、風味及口感等方面仍然存在差異[9]。血紅蛋白是肉類食品的調味劑和著色劑，使用血紅蛋白作為添加劑可以極大地提高代肉食品的口感和風味，極具食品工業應用前景。但是化學法提取血紅蛋白的難度大，不具有經濟性，且需要大量的動物血液，同樣會引起過度畜牧帶來的土地、水資源的浪費及溫室效應的加劇，從而造成環境惡化[10]。將微生物法發酵生產的血紅蛋白應用于代肉制品，可以極大地提高代肉制品的口感和風味。微生物發酵法早在2016年就被應用于素肉漢堡中[11]，也打開了微生物表達血紅蛋白的熱潮。本文對目前微生物合成的主要血紅蛋白種類、微生物高效表達血紅素及血紅蛋白的研究進展進行了簡要歸納和總結，為今后開發微生物源血紅蛋白產品提供了理論基礎，并簡要歸納了血紅蛋白及其衍生物在食品中的應用，以期促進血紅蛋白在食品制造業中的進一步發展。

1 微生物合成的主要血紅蛋白種類

血紅蛋白的結構及存在部位見圖1。

目前已有15種不同來源的血紅蛋白在微生物中表達[12]，根據參與合成的生物體及組成結構的不同主要研究集中在動物血紅蛋白、動物肌紅蛋白、微生物血紅蛋白及植物血紅蛋白方面。動物血紅蛋白（hemoglobin）是紅細胞的重要組成成分，存在于血液中，是血紅素輔基和珠蛋白組成的輔助因子蛋白，有輸送和儲存氧氣等重要作用。動物血紅蛋白是由兩條α鏈和兩條β鏈組成的四級結構[13]，每條鏈含有一個血紅素基團，其中血紅素基團中心的亞鐵離子承擔機體氧氣運輸的功能[14]。動物肌紅蛋白（myoglobin）存在于動物肌肉組織中，是一種結合蛋白，相比于血紅蛋白的簡單結構，由一條肽鏈和一個血紅素輔基組合而成。肌紅蛋白只存在于動物的心肌及骨骼肌肉中，在肌細胞中具有轉運和儲存氧的功能，在心肌受損時從心肌細胞中彌散出進入血液循環。動物肌紅蛋白結構簡單，微生物合成難度不大，目前的研究已經相對成熟。透明顫菌血紅蛋白（vitreoscilla hemeglobin）是由2個相同的亞基組成的同型二聚體，透明顫菌血紅蛋白被應用在天然產物藥物、藥物前體或醫藥中間體、保健品功能因子及生物醫療材料等生物醫藥生產應用研究中[15]。透明顫菌血紅蛋白基因vgb在釀酒酵母中過表達可改變細胞的氧化狀態，促進活性氧的累積，很好地解決了高密度發酵溶氧率問題[16]。透明顫菌血紅蛋白的應用主要體現在提高微生物代謝產物的產量和增加生物修復能力上，將其應用于食品方面并沒有研究。作為食品添加劑，豆血紅蛋白（leghemoglobin）在食品制造行業中的應用最廣泛。豆血紅蛋白是單體血紅蛋白，由一個血紅素輔基和一條肽鏈組成，存在于豆科植物根上的固氮結節中，是根瘤菌感染大豆后產生的血紅蛋白[17]。豆血紅蛋白能賦予食品牛肉的風味與顏色，已經在食品制造業中作為添加劑得以應用。但是化學法提取豆血紅蛋白的工藝復雜，且種植耗費的時間長，使得生產豆血紅蛋白的成本過高[18]。微生物發酵法替代傳統的化學法生產豆血紅蛋白，可降低成本，提高工作效率，以其作為食品調味劑應用于食品中，已經獲得了美國食品藥品監督管理局的批準使用。

2 微生物高效表達血紅蛋白的策略及研究進展

在微生物宿主方面，枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、大腸桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母等9種微生物已被應用于合成血紅蛋白[12]。血紅蛋白的高效表達依賴于血紅素的高水平供應和蛋白的正確表達，主要通過以下3種策略實現：強化血紅素的合成途徑來提高血紅素的供應；優化血紅蛋白表達策略來提高球蛋白和血紅素的結合率以保證血紅蛋白的正確表達；優化微生物表達血紅蛋白的發酵條件來進一步提高血紅蛋白的表達量。

2.1 血紅素合成途徑的優化

血紅素是合成血紅蛋白的輔基，具有攜氧能力，是生命體代謝活動中不可缺少的小分子物質，它存在于動物、植物、細菌、真菌、藍藻等生命體中。血紅素是一種鐵卟啉化合物，由卟啉和亞鐵構成，通過改變側鏈形成不同結構的衍生物[19]。血紅素的基本結構是卟啉中心螯合亞鐵離子形成的共軛結構，化學性質比較穩定[20]。大多數生物都可以內源合成血紅素，主要分為兩種途徑：C4途徑與C5途徑。C4途徑與C5途徑的主要差別在于5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）上游途徑的不同。5-ALA是一種非蛋白氨基酸，是四吡咯途徑中合成血紅素、葉綠素、細胞色素及維生素B12的中間體，據研究，5-ALA與血紅素的產量呈顯著正相關[21]。

2.1.1 5-ALA上游途徑的優化

2.1.1.1 C4途徑5-ALA上游優化

C4途徑也稱Shemin途徑（見圖1），它存在于哺乳動物、鳥類、真菌等生物中[22]。在C4途徑中，5-ALA是琥珀酰輔酶A與甘氨酸在ALA合成酶（ALAS）的作用進一步反應縮合而成的。提高血紅素的產量首先需要篩選高效的ALA合成酶。在2014年，研究人員對莢膜紅桿菌、農桿菌、球形紅桿菌的ALA合成酶進行對比，發現莢膜紅桿菌的ALAS活性最高，通過菌體利用C4途徑異源表達后，獲得了產量為8.8 g/L的5-ALA[23]。在2018年，張俊麗等[24]表達了來自釀酒酵母中的ALAS hemA基因并整合C5途徑5-ALA合成途徑，在添加前體物質甘氨酸和琥珀酸的條件下，ALA產量為525.8 mg/L，實現了在釀酒酵母中合成高產量的ALA。在2020年，Hsuan等[25]發現密碼子優化的莢膜紅桿菌ALAS異源表達可以獲得更多的可溶性ALAS，并進一步產生高水平的5-ALA。由于ALA是由TCA循環中的甘氨酸和琥珀酰輔酶A縮合而成的，研究人員也對TCA代謝流進行了改造。研究發現在有氧條件下敲除琥珀酸脫氫酶（SDH1）和富馬酸酶（FUM1），琥珀酸水平可增加2.7倍，SDH1的單獨缺失可使其提高1.6倍，可提高琥珀酰COA的產量[26]。且SDH1基因的敲除并不會對細胞生長產生影響而敲除琥珀酸脫氫酶（SUC3）基因，促進碳通量流向5-ALA會明顯抑制菌體的生長出現嚴重的代謝失衡，可能是由于琥珀酸脫氫酶在合成代謝中的特殊作用，無法合成琥珀酰COA將會抑制細胞的生長。在谷氨酸棒狀桿菌中引入C4途徑，并敲除琥珀酸脫氫酶（SdhA）和乙醛酸操縱子阻遏蛋白（IclR），進一步增強細胞中琥珀酰輔酶A的形成，同時抑制hemB基因表達，獲得5-ALA產量為6.93 g/L[27]。在釀酒酵母中，ACO1和ACO2編碼的烏頭酸酶是甘氨酸充足時TCA循環中的限速酶，與野生菌株S288C相比，ACO1缺失會導致菌的最大發酵速率降低35%[28]。過表達ALAS時ACO2的過表達可進一步增加5-ALA的合成[29]。

2.1.1.2 C5途徑5-ALA上游優化

C5途徑主要存在于高等植物、藻類和多種細菌中，以谷氨酸為前體合成5-ALA需要3種酶的參與分別是谷氨酸-tRNA合成酶（gltX）、谷氨酸-tRNA還原酶（hemA）和谷氨酸-1-半醛轉氨酶（hemL）。在C5途徑的研究中，通過共表達SerA、SerB及SerC基因，5-ALA產量提高69%，在此基礎上過表達glyA基因，使5-ALA產量提高1.5倍[30]。通過敲除乙酸和乳酸等副產物合成途徑相關基因以減少乙酰輔酶A的轉化，提高草酰乙酸含量也有利于5-ALA的產量[31]。5-ALA的合成與細胞內的氧化還原電勢有關，共表達蘋果酸酶基因maeB和hemA時，可以提高ALAS的活力[32]。同時發酵時添加甘氨酸和琥珀酸等前體物質、ALA脫氫酶的抑制劑左旋丙酸、乙酰丙酸、D-木糖等都可以增加5-ALA的產量[33]。且有研究顯示5-ALA在堿性條件下容易降解，產量隨著pH的降低而增加[34]。釀酒酵母作為一種耐酸菌株，由于其遺傳可馴化性、生命周期短和成熟的高密度發酵技術，以其作為底盤細胞將有利于5-ALA產量的增加。

2.1.2 5-ALA下游途徑的優化

除了提高前體5-ALA的產量外，控制血紅素的合成和降解途徑是最有效的手段。血紅素在ALA前體充分存在的情況下，經過ALA脫水酶（hemB）脫水縮合形成膽色素原，經過羥甲基膽素合成酶（hemC）脫氨縮合形成羥甲基膽素，再經過尿卟啉原Ⅲ合成酶（hemD）的作用脫水環化形成四吡咯環的尿卟啉原Ⅲ，從此步驟開始形成卟啉環，也是生物體內所有四吡咯類物質合成的共同前體[33]。尿卟啉原Ⅲ經過尿卟啉原Ⅲ脫羧酶（hemE）將4個側鏈脫羧合成糞卟啉原Ⅲ，糞卟啉原Ⅲ經過糞卟啉原Ⅲ氧化酶（hemF）對側鏈進行氧化脫羧形成原卟啉原Ⅸ，再經過原卟啉原Ⅸ脫氫酶（hemG）催化脫氫成原卟啉Ⅸ，最后在亞鐵螯合酶（hemH）的作用下，結合Fe2+形成血紅素[35]。血紅素的降解途徑一般與血紅素加氧酶（Hmx1）和參與有氧呼吸的Hap1p轉錄因子有關。血紅素加氧酶參與血紅素的氧化分解反應，分解產物為膽綠素、鐵和一氧化碳，有研究表明Hmx1基因的缺失會使血紅素的降解活動減弱，從而達到胞內的積累[36]。Hap1p是一種轉錄因子，參與有氧呼吸和氧化還原反應的激活，并負責血紅素的動態平衡。當胞內血紅素含量過高時，會誘導轉錄抑制因子Rox1p抑制血紅素合成途徑hemF轉錄形成負反饋以降低血紅素的合成[37]。在2003年，Kwon等[38]首次利用三質粒系統在大腸桿菌中組裝了整個血紅素合成途徑，得到的卟啉總濃度為90 μmol/L，血紅素濃度為3.3 μmol/L。通過優化血紅素合成基因的表達水平，刪除競爭通路，過表達血紅素輸出蛋白，使大腸桿菌的血紅素總產量達到1 034.3 mg/L[39]。過表達大腸桿菌的血紅素輸出蛋白ccmABC，血紅素的分泌率可提高63%。血紅素調節轉運體hrtA、hrtB以及細胞色素輸出蛋白ccsA可能參與細胞的分泌，重組過表達進行比較，顯示hrtAB更利于血紅素的產生，胞外分泌率達9.25%[40]。過表達C5途徑從L-谷氨酸開始的ALA生物合成途徑，敲除降解途徑基因pta、IdhA和yfex，以阻斷醋酸和乳酸的合成來優化代謝通量，過表達轉運蛋白ccmAB，使其產生73.4 mg/L血紅素，在培養基中添加ALA胞外血紅素產量為151.4 mg/L，占總產量239.2 mg/L的63.3%[41]。在大腸桿菌中構建并篩選具有最佳RBS強度的hemBCDEFY組合菌株，獲得的卟啉濃度為160.8 mg/L，再從誘變文庫中獲得了一個高活性的hemFECH變異體。對優化后的hemBCDEFY和hemFECH突變體的菌株分批發酵，得到最高產量為127.6 mg/L的血紅素[42]。在釀酒酵母中，Hoffman等[43]通過構建釀酒酵母血紅素合成基因過表達系統證明hemB、hemC為關鍵限速酶基因，同時hemE也具有限速酶的可能。Ishchuk等[44]對76個血紅素單獨敲除或者過表達，發現40個基因可增加血紅素的產生，研究發現過表達hemF可使血紅素產量提高300%，hemG、hemB、hemH、hemC及hemE也可使血紅素產量增加20%～70%。敲除不利基因、組合過表達有利基因后血紅素產量提高了70倍，血紅素產量達到53.7 mg/L。血紅素合成的最后一步是由鐵螯合酶（hemH）介導亞鐵插入卟啉環，從而產生血紅素。研究人員發現hemH與Mic60的動態關聯是線粒體接觸位點和嵴組織系統（MICOS）的核心成分。MICOS的缺失會對hemH的活性產生負面影響，影響酵母中血紅素的合成[45]。在谷氨酸棒狀桿菌中，結合兩種前體途徑，共表達通路基因和轉錄調控因子DtxR，過表達血紅素轉運蛋白，敲除血紅素結合蛋白實現了血紅素產量為（309.18±16.43） mg/L，胞外濃度為（242.95±11.45） mg/L[46]。將血紅素生物合成途徑分為4個模塊：內源C5途徑、異源C4途徑、尿卟啉原Ⅲ合成途徑和下游合成途徑。過表達谷氨酰t-RNA還原酶的hemA，敲除C5通路中谷氨酸脫氫酶rocG，血紅素產量增加了427%；過表達hemC、hemD、hemB，使血紅素的產量增加了39%；通過10 L發酵罐發酵，胞外血紅素產量為（221.83±4.71） mg/L，總血紅素產量為（248.26±6.97） mg/L[47]。這些研究均表明，在提高血紅素產量方面針對一個基因的敲除或者過表達并不能產生明顯的效果，當hemD表達量降低時，hemB會自發轉化為尿卟啉原 Ⅰ 從而減少尿卟啉原Ⅲ的合成，繼而減少血紅素的合成[48]。高水平的hemD和hemF過表達也會導致ALA的積累，說明血紅素的合成是由多個基因進行調控的，提高血紅素的產量需要對每個基因的表達水平進行調整。血紅素合成通路見圖2。

2.1.3 發酵條件的優化

發酵優化也是提高血紅素產量的重要手段。通過溫度、溶氧及外源添加物對卟啉合成前體5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）及終產物血紅素產量影響的分析，發現Fe2+、谷氨酸或葡萄糖均能提升5-ALA和血紅素的含量，37 ℃、200 mL 裝液量條件下添加0.2 mmol/L 葡萄糖，血紅素產量最高，可達34.45 μmol/L，比對照提高了10.79倍[49]。對培養基改良發現添加碳酸氫鈉和磷酸鹽緩沖液可使血紅素的生成速度提高60%，硫胺素等生長因子的添加使血紅素生成量提高1倍[50]。因此，提高血紅素產量的發酵策略基本是在培養基中補充前體物質、合成過程中的金屬離子及一些促生長因子、改善發酵環境這幾個方面。調整發酵工藝也能影響血紅素基因的表達水平，從而提高血紅素的產量[51]。研究人員運用分批補料的方法，在碳源耗盡和pH高于預設值時在發酵罐中自動添加培養基，使血紅素產量進一步提升[41]。高水平的氧氣會促進酵母細胞血紅素的合成，因此在C4途徑的優化中，除了添加前體ALA、琥珀酸和甘氨酸，控制溶氧率也能提高血紅素的產量。

2.2 血紅蛋白表達策略的優化

2.2.1 動物血紅蛋白表達策略的優化

微生物法合成動物血紅蛋白根據用途可以分為兩種：應用于醫學的人血紅蛋白和應用于食品的動物血紅蛋白。在人血紅蛋白的研究中通過外源添加血紅素，血紅蛋白產量能達到細胞總蛋白產量的5%～10%，且只有50%的血紅素被結合[52]。隨后研究人員在大腸桿菌中添加ALA使血紅素結合率從20%提高到68%[53]。但是研究發現細菌系統不能產生功能性的血紅蛋白，因此構建血紅蛋白真核表達系統來增加細胞內血紅素的可用性是目前研究的熱點。在釀酒酵母中，通過平衡球蛋白的表達和工程血紅素生物合成途徑，血紅蛋白的表達水平顯著提高到酵母細胞總蛋白的3%～4%，隨后對釀酒酵母中限速酶hemC過表達來增加血紅蛋白產量[54]，再通過敲除異源蛋白降解途徑使血紅蛋白積累到總蛋白的18%[55]。在動物血紅蛋白的研究中，薛繼科等[56]在選擇半乳糖誘導策略（pGAL1啟動子）對球蛋白進行誘導表達、去除血紅素合成過程中的空間屏障、增加5-ALA的合成、適度提高血紅素合成的限速步驟后，實現了（19.3±2.8） mg/L的牛血紅蛋白和（11.7±0.4） mg/L的豬血紅蛋白的微生物合成。此外，還獲得了產量為（108.2±3.5） mg/L的豆血紅蛋白、（68.9±1.6） mg/L的牛肌紅蛋白和（85.9±5.0） mg/L的豬肌紅蛋白。在大腸桿菌和畢赤酵母中通過構建載體誘導表達使得鱷魚血紅蛋白的產量分別為3.0 mg/L和6.0 mg/L[57]。相比于動物肌紅蛋白，動物血紅蛋白的產量明顯較低，可能是由于動物血紅蛋白結構比較復雜，折疊形成正確的結構難度較大，所以在食品應用方面可以替代的動物肌紅蛋白成為了研究的潛力方向。

2.2.2 動物肌紅蛋白表達策略的優化

戎倩倩[58]在釀酒酵母中構建3種啟動子調控下的8個血紅素合成基因的質粒表達系統，敲除Hmxl、Hapl后組合調控獲得了血紅素產量為1.12 mg/（L·OD600），整合異源C5途徑基因并優化，進一步過表達hemC，菌株發酵96 h時血紅素產量達到104.5 mg／L，較搖瓶發酵結果提高了4.51倍。在此基礎上，利用eGFP的熒光特性和6×His組氨酸標簽，成功構建了普通牛肌紅蛋白與豆血紅蛋白的融合蛋白表達質粒，證明了輔基基團的生產可以用代謝工程的方式來實現，從而增加了高效生產含輔基基團的復雜蛋白質的可能性。利用促溶標簽MBP、TrxA等融合表達不同來源血紅蛋白畢赤酵母重組菌株，豬肌紅蛋白、牛肌紅蛋白、豆血紅蛋白在搖瓶條件下產量分別達到42.0，20.0，100 mg/L；并進一步優化豬肌紅蛋白在畢赤酵母中的分泌表達體系，最終構建得到的重組菌株48 h搖瓶發酵產量達到69.0 mg/L，較對照組提高了59.4%[59]。通過外源添加血紅素，重組豬肌紅蛋白增加到285.42 mg/L，在5 L發酵罐中血紅素結合率從12.5%增加至22%[60]。張博涵[61]在畢赤酵母中優化了表達宿主引入信號肽構建最佳組成型表達體系后，引入強啟動子GAP，經發酵優化后豬肌紅蛋白的最高產量為576.42 mg/L。相比于其他血紅蛋白，微生物合成的肌紅蛋白具有產量高、操作簡單、是動物源的血紅蛋白等優勢，更適用于食品的研究與開發。

2.2.3 豆血紅蛋白表達策略的優化

目前表達豆血紅蛋白的系統主要包括大腸表達系統和酵母表達系統，劉萌等[62]將攜帶豇豆血紅蛋白Lb Ⅱ基因的質粒pET-15b轉化進入大腸桿菌BL21中表達，并對表達條件進行優化獲得了產量為7.30 μg/mL的大腸桿菌表達菌株。蘇悅[63]以畢赤酵母為宿主，通過選擇合適的啟動子構建豆血紅蛋白表達重組菌，通過提高抗生素濃度，篩選得到高效表達重組菌，然后經甲醇誘導后豆血紅蛋白分泌表達量達到0.12 g/L，最后對發酵條件進行了優化，將重組菌豆血紅蛋白分泌表達量提高了66.7%，達到0.2 g/L。在2022年通過增加豆血紅蛋白基因拷貝數和強化內源血紅素途徑，構建了一株高效分泌活性豆血紅蛋白的畢赤酵母工程菌株，使得血紅蛋白最終產量達3.5 g/L，血紅素結合率達93%，是迄今為止在微生物細胞工廠中血紅蛋白的最高表達水平，有望實現工業化[64]。且該文章表示血紅素通路的8個基因對活性豆血紅蛋白的產生都具有積極作用，添加ALA可以增加細胞內血紅素的產量，從而促進豆血紅蛋白的正確折疊和分泌。但是添加ALA的豆血紅蛋白的比活性比添加血紅素的高42%，這是由于發酵液中血紅素通過酵母細胞膜的效率較低，即使在發酵液中存在過量的血紅素，也只能有小部分被轉化為血紅蛋白。隨后新的研究證明了在真核系統中存在著轉運血紅素的膜蛋白基因TANGO2，TANGO2的缺失會導致線粒體中的血紅素超載從而影響細胞的生長，且TANGO2可以結合血紅素并將其轉移到球蛋白并形成血紅蛋白[65]。后續的研究可以在調整整個血紅素合成通路基因的表達水平基礎上，對膜蛋白基因進行強化表達以提高血紅素的結合率及血紅蛋白的產量，不同微生物宿主高效合成血紅蛋白的技術策略見表1。

2.3 微生物表達血紅蛋白發酵條件的優化

發酵條件的優化對于血紅蛋白的合成也是比較重要的，陳林杰等[68]首先通過單因素試驗研究蛋白胨種類、大豆蛋白胨濃度、鐵鹽種類及血紅素濃度在誘導階段對畢赤酵母產豆血紅蛋白的影響，然后通過Plackett-Burman試驗設計篩選出對豆血紅蛋白產量影響最大的3個因素，得出4%大豆蛋白胨作為氮源、甲醇誘導濃度為1.5%、血紅素濃度為5 μmol/L時發酵效果較好，最后根據響應面結果進行搖瓶發酵和發酵罐高密度發酵。經過響應面優化后得到蛋白胨濃度51.48 g/L、pH 5.66、培養基裝液35.84 mL/250 mL 是最優發酵條件。在此條件下搖瓶發酵產量為191 mg/L，采用5 L發酵罐進行高密度發酵，豆血紅蛋白產量最高，達到384 mg/L。張博涵[61]經搖瓶發酵，最終確定了發酵條件為1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、1%甘油、0.4 mg/L生物素及40 mg/L氯化血紅素，肌紅蛋白最高產量為17.2 mg/L，在此基礎上進行發酵罐水平發酵優化，經終濃度150 mg/L氯化血紅素的流加發酵，肌紅蛋白最高產量達到576.42 mg/L。由此可以看出血紅蛋白的發酵也是從菌株對碳源、氮源、無機鹽和生長因子等方面的需求來進行優化的。除此之外，提高微生物內源血紅素的產量尤為關鍵，在血紅蛋白發酵優化的基礎上對血紅素的表達條件進行優化，可以提高血紅素的產量，進而保證血紅蛋白的正確折疊與表達。在發酵工藝方面，采用發酵罐發酵、分批補料、高密度發酵等科技手段針對不同微生物的特性有效控制發酵的多個環節也可以提高血紅蛋白表達量。

3 血紅蛋白及其衍生物在食品中的應用

3.1 血紅蛋白在傳統食品中的應用

血紅蛋白作為可食用調味品，已經廣泛應用于傳統食品領域。血紅蛋白由于其穩定的著色效果、良好的感官評價常被作為著色劑應用于素肉制品、腌肉制品、豬肉脯制品中以提高代肉及肉制品的風味。血紅蛋白作為著色劑用于肉制品中能完全替代亞硝酸鹽，降低了肉制品中的亞硝酸鹽殘留量，顯著增加了產品的安全性[70]。血紅蛋白肽是血紅蛋白的一種衍生物，是通過物理化學方法將血紅蛋白中的珠蛋白分解成短肽段，再與血紅素連接的生物活性肽。研究發現人類對活性蛋白肽的吸收率高，對于年老、體弱多病及術后人群直接攝入這種營養物質比經靜脈注射的氨基酸更易快速吸收[71]。血紅蛋白是一種溶解性良好的蛋白，經脫色得到珠蛋白，因其具有乳化脂肪的能力且穩定性良好常被應用于香腸和肉餡的制備中[72]。研究人員發現用酶水解技術可以提高豬血紅蛋白的乳化特性，通過優化酶解條件可以得到高乳化性的蛋白類產物，將產物添加到烤腸中不但可以代替瘦肉蛋白，還可以提高烤腸的品質[73]。從營養學的角度來看，膳食鐵通?？煞譃閮煞N形式：血紅素鐵和非血紅素鐵。非血紅素鐵主要包括硫酸亞鐵、葡萄糖酸亞鐵等[74]。血紅素鐵由其具有較高的生物利用度和較少的副作用可以作為天然的補鐵劑治療營養不良或妊娠期貧血等疾病[75]。

3.2 血紅蛋白在未來食品中的應用

現階段向植物、動物、微生物要熱量、要蛋白的未來食品的發展已啟步，作為其代表的植物蛋白肉制品也逐漸出現在日常生活中。植物蛋白肉是利用大豆、小麥、豌豆等植物蛋白，通過合成、加工而形成的具有肉類營養價值、口感和風味的食品[76]。植物蛋白肉相較于傳統養殖肉具有高植物性蛋白質、少量的脂肪、無激素、富含多種氨基酸、低飽和脂肪、無反式脂肪、富含膳食纖維、無膽固醇等優勢，更適合于有特殊肉類需求的人群食用[77]。目前能有效形成纖維狀蛋白質結構、規?；a的植物蛋白肉加工工藝主要包括3種紡絲技術、擠壓技術和食品3D打印技術[78]。食品3D打印技術采用逐層材料沉積模式，制造的食品在質構與外觀上更加逼真，近年來也成為研究的熱點[79]。除了質構外，口感和色澤也是人造肉制品獲得市場認可度的關鍵，血紅蛋白作為植物蛋白肉制品的顯色及調味劑可以大幅改善口感及擬真性。利用畢赤酵母合成的豆血紅蛋白早在2016年已被Impossible Foods 公司應用于植物基漢堡中。微生物法合成血紅蛋白應用于植物蛋白肉制品已具備市場基礎，其安全性也已被證實[11]。通過添加血紅蛋白、風味肽、維生素等物質，科學復配使植物肉不僅與傳統肉類的外觀、色澤、口感高度相似，氨基酸組成更合理且降低了肉類帶來的疾病患病率，為人們的健康生活方式提供了更多選擇。未來的發展中可以對不同的人群進行評估，通過改變植物蛋白肉與真實肉的混合比例來控制蛋白質與氨基酸的攝入，將會更有利于人類的健康，血紅蛋白及其衍生物在食品中的應用見圖3。

4 結論與展望

微生物高效表達血紅蛋白主要通過強化不同宿主內源血紅素合成途徑、敲除血紅素加氧酶等策略來減少血紅素的降解以提高血紅素的產量；通過調整蛋白表達策略使血紅素輔基與球蛋白高效結合，過表達血紅素轉運蛋白增加血紅蛋白的產量；通過在培養基中添加血紅素及血紅蛋白合成相關的輔因子及前體物質來優化發酵條件等策略來提高微生物血紅蛋白表達量。微生物法表達各種血紅蛋白的研究已然相對成熟，但是依然存在著諸多問題，比如大腸桿菌細胞內還原性環境不利于蛋白質分子間二硫鍵的形成，會造成蛋白未折疊或折疊不完全使蛋白無功能性和活性，產品純化比較困難[67]；非食品級的畢赤酵母底盤細胞同樣也能帶來潛在的食品安全隱患；植物來源的豆血紅蛋白在結構和功能上與動物來源的血紅蛋白存在著一定的差異等。因此，未來應將尋找食品級底盤細胞、運用已成熟的血紅素改造途徑和蛋白表達策略生產動物來源的血紅蛋白或者肌紅蛋白作為研究的重心。

微生物表達血紅蛋白作為未來食品的研究熱點，是食品和生物技術的有效結合，其囊括了合成生物學、發酵工程、基因工程等，是多學科交叉融合的產物。利用微生物合成的方法不僅能夠滿足人類對食品營養、安全、美味等方面的需求，而且可以減少資源的消耗，降低對環境的影響。以其作為調味劑應用于植物基代肉未來食品中可滿足大眾對代肉制品視覺及口感上的需求，也證明了未來食品的生產模式可以更加綠色、高效和可持續。未來食品的發展前景非常廣闊，加大對未來食品、植物蛋白肉及微生物合成血紅蛋白的宣傳，提高民眾的關注與信任度，以促進未來食品行業的高質量發展。

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收稿日期：2023-07-17

基金項目：河南省重大公益專項（201300110300）；中原學者工作站資助項目（224400510026）；河南省中央引導地方科技發展資金項目（Z20221341069）；功能糖發酵菌株創制及綠色生物制造關鍵技術研究與應用（231111310700）；河南省重大科技專項（221100110700）

作者簡介：王慶沛（1997－），女，碩士，研究方向：食品加工與安全。

*通信作者：黃繼紅（1965－），女，教授級高級工程師，博士，研究方向：農產品精深加工。