NRG1基因修飾的骨髓基質干細胞移植對大鼠脊髓半橫切損傷的修復作用及其機制

符禹玄，陳君，趙富生，李媛媛，張可心，武庚*

1牡丹江醫學院第一臨床醫學院骨科，黑龍江牡丹江 157000；2牡丹江醫學院組織學與胚胎學教研室，黑龍江牡丹江157000

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種由交通事故、高處墜落等引起的嚴重中樞神經系統疾病，主要表現為脊髓受損平面以下感覺、運動和自主神經功能障礙或喪失，可嚴重影響生活質量，同時給患者家庭和社會帶來沉重的經濟負擔[1]。SCI可分為原發性和繼發性損傷兩個連續的病理階段[2]。原發性SCI 多因脊柱骨折壓迫脊髓引起，繼發性損傷是由水腫、炎癥反應、氧化應激、鈣超載、神經元凋亡等繼發性損害因素引起的一系列病理變化[3-4]。因此有效抑制神經元壞死和凋亡，恢復神經傳導功能，成為臨床治療SCI 的重點和難題[5]。神經調節蛋白1(neureglin1，NRG1)是一種含表皮生長因子樣結構域的跨膜蛋白，屬于神經生長因子家族，參與突觸塑形、髓鞘形成、神經細胞發育及成熟等多種生理過程[6]。研究發現，NRG1 與其下游信號受體ErbBs 結合，形成同源二聚體或異二聚體，通過激活胞內酪氨酸激酶，參與調控神經元和膠質細胞的增殖和分化過程[6]。NRG1還與阿爾茨海默病、帕金森病等多種神經退行性疾病的發生發展相關[7]。骨髓基質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中的非造血干細胞，具有高度自我復制能力和多向分化潛能[8-10]。BMSCs可分泌多種神經細胞營養因子，如血管內皮生長因子、腦源性神經營養因子等，改善損傷局部微環境，促進損傷細胞修復[8]。BMSCs 易于進行基因修飾，并能夠穩定表達外源基因[11]，且取材方便，易于擴增，可降低免疫排斥反應，因而成為較理想的組織工程種子細胞[12]。有研究發現，在大鼠大腦中動脈閉塞模型中，BMSCs 移植可減輕卒中后腦組織損傷[13]。本研究通過建立大鼠SCI模型，移植并觀察NRG1-BMSCs對SCI的修復作用，以期為臨床治療SCI提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 pcDNA3.1(+)-Nrg1-IRES/eGFP 質粒由廣州賽業生物科技有限公司構建及鑒定；DMEM 培養液、胎牛血清、ECL 化學發光試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；青鏈霉素雙抗溶液(SV30010，美國Hyclone 公司)；FuGene6(E269，美國Promega 公司)；NRG1 ELISA 試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?；兔抗鼠葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、轉錄激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)、ATF6、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、X-box結合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)、B 淋巴細胞瘤-2 蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2 相關X蛋白(Bcl-2-asslciated protein X，Bax)抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)。PVDF膜(上海碧云天生物技術有限公司)；CO2細胞培養箱(MCO-15AC，日本SANYO公 司)；微 量 注 射 器(UMC4 Micro4TMController)、Model ELX800 酶標儀(ELX800，美國Bio-Tek 公司)；冷凍切片機(CM3050S，德國Leica 公司)；體視顯微鏡(SMZ745T，日本Nikon公司)；激光共聚焦顯微鏡(LSM700，德國Zeiss 公司)；凝膠成像系統(Gel Doc XR+，美國Bio-Rad 公司)；Image-Pro PLUS 圖像分析軟件(美國Meyer Instruments公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物 4 周齡SPF 級SD 大鼠4 只，體重(100±5) g，用于BMSCs 分離培養；8 周齡SPF 級SD大鼠43 只，雌22 只，雄21 只，體重(280±20) g，由牡丹江醫學院實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證號：SYXK(黑)2019-006]。實驗前適應性飼養1周，環境溫度20～24 ℃，濕度42%～46%，晝夜12 h 交替光照，自由攝食飲水。實驗過程符合國家及單位實驗動物的管理和使用規定。

1.2.2 BMSCs 分離培養 將4周齡SD 大鼠頸椎脫臼處死，置70%乙醇中浸泡10 min，無菌條件下分離股骨和脛骨，剪除骨骺，暴露骨髓腔，用20 ml DMEM 培養液沖洗骨髓腔，經200 目無菌篩網過濾后，將細胞接種于50 ml 培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，72 h后更換培養液，去除未貼壁細胞，之后每隔3 d更換1次培養液，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化，并采集圖像。當細胞融合度達80%～90%時，進行傳代培養，取第3 代BMSCs進行后續實驗。

1.2.3 NRG1 質 粒 轉 染BMSCs 將BMSCs 按1×105個/ml接種于6孔板，當細胞融合度達80%時，按照FuGene6 說明書將NRG1 質?；蚩蛰d質粒轉染入BMSCs，具 體 操 作 如 下：取91 μl DMEM、6 μl FuGene6、3 μl NRG1 質?；靹蚝蠹尤隑MSCs 培養液中，培養48 h 后更換含G418 的培養液，收集G418抗性NRG1-BMSCs 擴增培養，在熒光顯微鏡下觀察BMSCs 轉染情況，并采集圖像。按照ELISA 試劑盒說明書步驟分別檢測BMSCs 和NRG1-BMSCs 裂解液及培養液中NRG1蛋白含量。

1.2.4 細胞增殖檢測 取生長狀態良好的BMSCs 和NRG1-BMSCs，制備細胞懸液，調整細胞密度為1×105個/ml，以每孔相同的細胞數接種于24 孔板，連續培養14 d，每天取3孔細胞消化，應用細胞計數板計數，取平均值繪制細胞生長曲線。

1.2.5 動物實驗分組及脊髓半橫切損傷模型制備取8周齡SPF級SD大鼠隨機分為對照組(n=10)、SCI模型組(n=10)、空載體-BMSCs(BMSCs)組(n=10)和NRG1-BMSCs 組(n=13，其中3 只用于細胞遷移檢測)。SCI 模型組、BMSCs 組和NRG1-BMSCs 組大鼠參照趙富生等[14]的方法，建立脊髓半橫切模型。具體操作如下：用1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定于手術臺上，背部手術區去毛、消毒，以T8棘突為中心，行背部正中縱行切口，長約3 cm，用眼科彎鑷鈍性分離筋膜及雙側椎旁肌，暴露T7-T9三個棘突、雙側椎板及橫突，用止血鉗固定T8并輕輕向上提起，張開椎間隙，剪除T8棘突及棘突下椎板暴露脊髓，在體式顯微鏡下，用眼科虹膜刀緊貼脊髓正中動脈右側垂直刺入脊髓至椎管底部，刀鋒向右劃動至右側脊髓完全橫斷，大鼠即刻出現一過性鼠尾連續性抽動和后肢持續性痙攣，表示造模成功。術后使用無菌明膠海綿填塞術區，逐層縫合硬脊膜、肌肉、筋膜和皮膚，注射青霉素(20 萬U/kg)，2 次/d，連續3 d，將飼料、飲水置于大鼠可及范圍，保持墊料干燥。

造模成功后2 h，BMSCs 組和NRG1-BMSCs 組大鼠在脊髓損傷中心(垂直進針)以及損傷中心上、下0.5 cm 處傾斜45°進針，刺入深度為1.5 mm，使用微量注射器以5 μl/min 勻速注入5 μl BMSCs 或NRG1-BMSCs 懸液(1×107個/ml)至皮質脊髓側束(圖1)，注射后留針3 min；SCI 模型組以同樣方法注入15 μl PBS。對照組僅行T8棘突及椎板切除術。

圖1 大鼠脊髓半橫切損傷模型及細胞移植示意圖Fig.1 Schematic diagram of rat spinal cord hemisection injury model and cell transplantation

1.2.6 大鼠術后運動功能和脊髓組織病理學及相關蛋白表達水平觀察

1.2.6.1 NRG1-BMSCs 遷移及分布觀察 細胞移植第7天，隨機選取NRG1-BMSCs組3只大鼠，用1.5%戊巴比妥鈉過量麻醉后，左心室插管灌注4%多聚甲醛溶液，切取損傷節段脊髓用OCT包埋，冰凍切片機常規切片(厚度6～10 μm)。采用DAPI 染細胞核，用抗熒光淬滅劑封片后，于熒光顯微鏡下觀察NRG1-BMSCs遷移及分布情況。

1.2.6.2 大鼠后肢運動功能評估 造模后第1、7、14、21、28 天，各組隨機選取6 只大鼠進行BBB 評分和斜板實驗。BBB 評分范圍為0～21 分，0 分表示癱瘓，21 分表示后肢運動功能正常。斜板實驗將大鼠置于平坦、不光滑的斜板上，斜板由0°緩慢上升，每次升高5°，大鼠堅持時間至少5 s不從斜板上跌落為成功，使用量角器測量斜板角數。實驗采用雙盲、雙人獨立完成評價，最終結果取平均值。

1.2.6.3 HE 染色、Nissl 染色和TUNEL 染色 完成BBB 評分和斜板實驗后，各組隨機選取5 只大鼠經1.5%戊巴比妥鈉過量麻醉后，剖胸行左心室插管，灌注4%多聚甲醛溶液固定，切取0.5 cm損傷節段脊髓，以損傷為中心橫斷為兩段，一段制備石蠟切片行HE 染色和Nissl 染色，另一段制備冰凍切片行TUNEL染色。

HE染色：石蠟切片經二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后，蘇木精染液染色10 min，1%酸性乙醇浸泡5 s，蒸餾水漂洗，置于伊紅溶液中染色5 min，經梯度乙醇脫水、中性香脂封片后，于光學顯微鏡下觀察組織形態結構，并采集圖像。

Nissl 染色：切片經脫蠟水化后，置于Nissl 染液中染色，于光學顯微鏡下觀察脊髓組織神經元形態結構以及尼氏體密度和分布情況。

TUNEL 染色：取冰凍切片，按照TUNEL 試劑盒說明書進行染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，TUNEL 陽性細胞呈現紅色熒光，采用ImageJ 軟件分析TUNEL 陽性細胞率。TUNEL 陽性細胞率(%)=(TUNEL陽性細胞數/DAPI染色細胞數)×100%。

1.2.6.4 Western blotting 檢測脊髓組織中內質網應激相關蛋白及凋亡相關蛋白的表達 完成BBB 評分和斜板實驗后，取各組剩余5 只大鼠的脊髓組織，經RIPA 裂解、離心，取上清采用BCA 法測定蛋白含量。通過SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，經轉膜、封閉后，加入XBP1(1∶1000)、CHOP(1∶800)、ATF4(1∶1000)、ATF6(1∶1000)、GRP78(1∶800)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶400)和β-actin(1∶2000)一抗，4 ℃孵育過夜，次日TBST清洗3次，加入相應二抗37 ℃孵育2 h，滴加ECL發光試劑，置于成像儀中成像，應用ImageJ軟件分析目的蛋白條帶相對灰度值。

1.3 統計學處理 應用SPSS 18.0 軟件進行統計分析。所有數據以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，進一步兩兩比較采用Bonferroni 校正t 檢驗；方差不齊時，進一步兩兩比較采用Tamhane's T2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 BMSCs 培養及NRG1 基因修飾 倒置相差顯微鏡觀察顯示，培養第1 天，BMSCs 呈圓形、不規則形或多角形，分布均勻(圖2A)；培養第3 天，BMSCs 形成多個散在集落，緊密排列呈聚集生長(圖2A)；傳代培養后，BMSCs 分布均勻呈長梭形或束狀生長(圖2A)。熒光顯微鏡觀察顯示，轉染NRG1基因后，BMSCs呈明亮綠色熒光(圖2B)。

ELISA 法檢測結果顯示，BMSCs 培養液和裂解液中NRG1 含量在轉染24 h 略有升高，但差異無統計 學 意 義(P＞0.05)，轉 染48 h 明 顯 升 高(P＜0.05，圖2C、D)。

細胞增殖檢測結果顯示，BMSCs 和NRG1-BMSCs生長曲線呈S形(圖2E)。接種后第1～3天為滯留期，第6～8天進入對數生長期，第12天達到高峰，此后細胞生長緩慢，進入平臺期，且NRG1-BMSCs增殖速度明顯快于BMSCs(P＜0.05，圖2E)。

2.2 NRG1-BMSCs 遷移和分布情況 移植第7 天，NRG1-BMSCs 大鼠脊髓組織切片中可觀察到呈現綠色熒光的移植細胞，細胞呈圓形、橢圓形或不規則形狀，多聚集在損傷中心，偶見少量NRG1-BMSCs向損傷中心周圍區域遷移擴散(圖3)。

圖3 GFP標記的NRG1-BMSCs在脊髓組織內示蹤觀察(A-C，×50；D，×100)Fig.3 Trace observation of GFP-labeled NRG1-BMSCs in spinal cord tissues

2.3 各組大鼠后肢運動功能比較 術前各組大鼠BBB 評分均為21 分。術后第1、7、14、21、28 天，SCI模型組、BMSCs組和NRG1-BMSCs組BBB評分均明顯低于對照組(P＜0.05)。術后第7、14 天，SCI 模型組、BMSCs 組和NRG1-BMSCs 組BBB 評分均較術后第1 天增高，但組間比較無統計學差異(P＞0.05)；術后第21、28 天，NRG1-BMSCs 組BBB 評分明顯高于SCI 模型組和BMSCs 組(P＜0.05)，BMSCs 組與SCI模型組BBB評分無統計學差異(P＞0.05，圖4A)。

圖4 移植后不同時間點各組大鼠BBB評分和斜板傾斜角度比較Fig.4 Comparison of the BBB scores and the slope angle of rats in each group at different time points after transplantation

術前各組大鼠斜板實驗均為60°，術后第1、7、14、21、28 天，SCI 模 型 組、BMSCs 組 和NRG1-BMSCs 組斜板傾斜角度均明顯低于對照組(P＜0.05)。術后第7、14 天，SCI 模型組、BMSCs 組和NRG1-BMSCs 組斜板傾斜角度均較術后第1 天增高，但組間差異無統計學意義(P＞0.05)；術后第21、28 天，NRG1-BMSCs組斜板傾斜角度明顯高于SCI模型組和BMSCs組(P＜0.05)，BMSCs組與SCI模型組斜板傾斜角度無統計學差異(P＞0.05)(圖4B)。

2.4 各組大鼠脊髓組織病理學改變 HE 染色結果顯示，移植第28天，對照組脊髓組織結構清晰，神經元形態結構正常，細胞核大而圓，核仁明顯；SCI模型組脊髓灰質中有炎性細胞浸潤，空洞較多，可見神經元核固縮、凋亡；BMSCs 組脊髓組織結構紊亂，神經元形態不規則，空洞明顯；NRG1-BMSCs組脊髓組織中炎性細胞浸潤明顯減少，神經元核固縮、壞死減輕，空洞減少(圖5)。

圖5 各組大鼠脊髓組織HE染色(×200)和Nissl染色(×200)Fig.5 HE staining and Nissl staining of spinal cord tissues of rats in each group

Nissl 染色結果顯示，對照組神經元胞質中尼氏體豐富、染色清晰；SCI 模型組神經元溶解、破壞，尼氏體密度降低；BMSCs組神經元排列紊亂、皺縮，尼氏體減少；NRG1-BMSCs組神經元形態結構完整，尼氏體密度明顯增加(圖5)。

2.5 各組大鼠脊髓組織中內質網應激相關蛋白表達水平比較 Western blotting檢測結果顯示，與對照組相比，SCI 后大鼠脊髓組織中內質網應激相關蛋白XBP1、CHOP、ATF4、ATF6 和GRP78 表達水平明顯升高(P＜0.05)；經NRG1-BMSCs移植治療后，內質網應激相關蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)，但未恢復到對照組水平(P＜0.05)；SCI模型組與BMSCs組脊髓組織中XBP1、CHOP、ATF4、ATF6 和GRP78 蛋白表達水平差異無統計學意義(P＞0.05)(圖6)。

圖6 各組大鼠脊髓組織內質網應激相關蛋白XBP1、CHOP、ATF4、ATF6和GRP78表達水平比較Fig.6 Comparison of expression levels of endoplasmic reticulum stress-related proteins XBP1, CHOP, ATF4, ATF6 and GRP78 in rat spinal cord tissues

2.6 各組大鼠脊髓組織TUNEL 染色陽性細胞率比較 細胞移植第28 天，SCI 模型組脊髓損傷區域可見大量TUNEL 陽性細胞(細胞核呈紅色)，而NRG1-BMSCs 組TUNEL 陽性細胞明顯減少(圖7)。NRG1-BMSCs 組TUNEL 陽性細胞率明顯低于SCI 模型組(P＜0.05)，但 高 于 對 照 組(P＜0.05)；SCI 模 型 組 與BMSCs 組TUNEL 陽性細胞率差異無統計學意義(P＞0.05)(圖7)。

圖7 各組大鼠脊髓組織TUNEL陽性細胞率比較(TUNEL ×200)Fig.7 Comparison of TUNEL-positive cells rate in spinal cord tissues of rats in each group (TUNEL ×200)

2.7 各組大鼠脊髓組織中凋亡相關蛋白表達水平比較 Western blotting 檢測結果顯示，細胞移植第28天，與對照組相比，SCI 后大鼠脊髓組織中Bcl-2 蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)，Bax 蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05)；NRG1-BMSCs組損傷節段脊髓組織中Bcl-2 蛋白表達水平明顯高于BMSCs 組和SCI 模型組(P＜0.05)，而Bax 蛋白表達水平明顯低于BMSCs 組和SCI 模型組(P＜0.05)；BMSCs 組與SCI 模型組Bcl-2、Bax 蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)(圖8)。

圖8 各組大鼠脊髓組織中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達水平比較Fig.8 Comparison of expression levels of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax in spinal cord tissues of rats in each group

3 討 論

SCI通常是由脊柱創傷引起的破壞性中樞神經系統疾病，目前其治療方法主要包括藥物治療、手術減壓、康復理療等手段，但均未取得滿意效果。本研究采用脊髓半橫切損傷模型，探討移植NRG1 基因修飾的BMSCs 對SCI 的保護作用，結果顯示，NRG1能夠提高BMSCs的治療效果，促進大鼠SCI后運動功能恢復，其機制可能與增加BMSCs 增殖活性、抑制脊髓組織細胞凋亡、減輕內質網應激有關[15]。

BMSCs 具有在特定條件下分化為神經細胞的特性，并可自體移植、促進軸突再生，因而在中樞神經系統疾病治療中應用前景廣闊[16]。研究發現，BMSCs 中MHC-I 類分子表達水平較低，且缺乏MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子表達，這些特性致使BMSCs 移植后極少引起同種異體免疫排斥反應[17]。此外，BMSCs 通過分泌白細胞抗原G5、T 淋巴細胞發育抑制因子、白血病抑制因子以及γ 干擾素，可使其免受T淋巴細胞和NK細胞的損害[17]。有研究發現，將BMSCs 移植于SCI 模型大鼠中，大鼠損傷部位M2 型巨噬細胞數量明顯增多，M1 型巨噬細胞數量明顯減少，且脊髓組織中TNF-α、IL-6 含量也明顯減少，提示BMSCs 可減輕SCI 炎癥反應。同時，BMSCs 能夠減輕SCI 后神經性疼痛，阻止血脊髓屏障破壞，抑制星形膠質細胞增生引起的瘢痕形成[18]。但研究發現，單純移植BMSCs 治療效果有限，聯合其他治療方式或進行基因修飾能夠顯著提高BMSCs的治療效果[17]。有研究發現，將KLF7 基因導入BMSCs，可明顯上調BMSCs 中KLF7 的表達，提高BMSCs的增殖活性，抑制BMSCs凋亡，增高BMSCs中神經生長因子分泌水平[19]。本研究成功分離培養BMSCs，并轉染NRG1基因。在NRG1修飾的BMSCs培養液和細胞裂解液中，NRG1 表達水平呈時間依賴性增高，并能夠顯著增加BMSCs 的增殖活性，提示將NRG1-BMSCs 移植到脊髓組織可能增加損傷組織中NRG1 含量，一定程度改善局部微環境，促進神經修復。同時，NRG1 也可能促進BMSCs 存活以及向損傷部位遷移，改善神經功能。有研究發現，應用NRG1 基因轉染人脂肪源性基質干細胞，能夠上調該細胞中NRG1的表達；將NRG1高表達的脂肪基質干細胞注射到大鼠紋狀體14 d 后，可增高大鼠腦組織中NRG1 蛋白表達水平，促進卒中大鼠肢體運動功能恢復[20]。NRG1 是神經調節蛋白家族中信號蛋白，含有表皮生長因子樣結構域，通過與其下游ErbB2、ErbB3 和ErbB4 受體結合，介導神經元遷移分化、髓鞘形成、神經肌肉接頭發育，參與調節神經元興奮性、突觸塑形、神經傳遞，以及維持腦穩態，并在學習和記憶過程中發揮重要作用[21]。有研究發現，鞘內注射NRG1蛋白可減輕SCI后炎癥反應，減少硫酸軟骨素聚糖蛋白生成，抑制損傷區膠質瘢痕形成，促進SCI后大鼠神經功能恢復[22]。

研究發現，BMSCs 可合成包括外泌體在內的多種細胞因子，抑制損傷局部炎癥反應、細胞凋亡，進而促進SCI后神經功能修復[23]。有臨床研究報道，經椎管內移植或靜脈輸注BMSCs，2 年后核磁共振成像顯示SCI 患者脊髓組織結構改善，肢體感覺和運動功能明顯恢復，且無感染、疼痛及腫瘤形成等并發癥發生[24]。體視學檢查發現，經靜脈移植BMSCs 可阻止SCI 后脊髓灰質和白質體積減小，抑制損傷區神經元凋亡[25]。本研究HE 染色和Nissl 染色結果顯示，NRG1-BMSCs 移植后大鼠脊髓組織灰質和白質結構清晰，壞死區明顯縮小，脊髓灰質中神經細胞形態清晰可見，大部分神經元形態結構正常，提示移植NRG1-BMSCs 有利于抑制SCI 引起的核固縮，恢復受損神經元尼氏體密度，減輕SCI 誘導的神經元損傷，進而促進SCI 后神經電生理功能恢復。有研究發現，BMSCs 移植結合超短波治療可抑制SCI 后空洞形成，減輕損傷組織炎癥反應，促進大鼠運動誘發電位恢復[26]。本研究通過原位移植NRG1-BMSCs治療SCI，經BBB運動功能評分和斜板實驗觀察顯示，NRG1-BMSCs能明顯改善大鼠SCI后肢體運動功能。由此推測，移植攜帶外源性NRG1基因的BMSCs 可能通過改善損傷局部微環境，抑制細胞凋亡過程，從而促進大鼠SCI 后肢體運動功能恢復。

研究發現，內質網應激介導的細胞凋亡參與SCI的病理過程[27]。內質網是真核生物細胞中一種重要細胞器，具有合成、修飾和轉運蛋白質的功能。內質網應激為細胞的一種防御和自我保護機制，但劇烈而持久的內質網應激反應可導致細胞損傷甚至凋亡[28-29]。在SCI過程中，機體在炎癥、氧化應激或其他致病因素刺激下，內質網功能可能受到影響，導致錯誤折疊蛋白在內質網中堆積，繼而誘發內質網應激反應。研究發現，當內質網應激持續存在時，機體可通過啟動內質網信號途徑激活凋亡相關因子而誘發細胞凋亡[30]。蛋白激酶類RNA 內質網激酶(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)是位于內質網膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，也是參與機體適應性應答的關鍵蛋白受體。正常生理條件下，PERK與GRP78結合處于無活性狀態；當內質網應激發生時，PERK與GRP78解離磷酸化而激活，促使eIF2α 活化并上調ATF4 的表達，進而促進CHOP蛋白合成，最終激活下游信號分子轉導，誘發細胞凋亡[31]。研究發現，內質網應激在SCI 早期即被激活，在脊髓組織中內質網應激相關蛋白GRP78、PERK、eIF2α、CHOP表達明顯上調[32]，與本研究結果一致。本研究發現，SCI 大鼠脊髓組織中GRP78、ATF4、CHOP、XBP1、ATF6 蛋白表達水平明顯增高，經NRG1-BMSCs 治療后，脊髓組織中內質網應激相關蛋白表達水平明顯降低，提示NRG1-BMSCs能夠調控內質網應激信號通路，減輕內質網應激引起的組織損傷，進而發揮神經保護作用。Bax基因是機體中主要的凋亡基因，具有促進細胞凋亡的作用。Bcl-2 主要定位于線粒體外膜上，通過調控線粒體膜通透性，發揮抑制細胞凋亡的作用[33]。本研究結果表明，NRG1-BMSCs 移植能夠減少脊髓損傷區TUNEL 陽性細胞數，同時降低脊髓組織中Bax 蛋白水平，提高Bcl-2 蛋白水平。由此推測，NRG1-BMSCs 可能通過調節內質網應激介導的凋亡途徑，抑制SCI誘導的細胞凋亡。

綜上所述，移植NRG1-BMSCs能夠促進大鼠SCI后運動功能恢復，其作用機制可能包括：(1)NRG1促進BMSCs 在脊髓組織內增殖、存活及遷移，參與受損神經組織修復，進而促進大鼠運動功能恢復；(2)NRG1-BMSCs 參與改善損傷局部微環境，促進軸突再生和髓鞘形成；(3)NRG1-BMSCs 可能通過分泌NRG1 及多種神經營養因子，促進神經組織結構重構；(4)NRG1-BMSCs 可能通過調節內質網應激介導的凋亡通路，抑制細胞凋亡。本研究結果表明，移植NRG1-BMSCs 能夠減輕SCI，改善大鼠運動功能，為其用于臨床治療SCI 提供了實驗依據。但本研究未深入探討NRG1-BMSCs 對大鼠脊髓組織分化、軸突再生及髓鞘化、膠質細胞增生和膠質瘢痕形成的影響，以及對脊髓損傷局部血管形成和炎癥反應的作用，后續需進一步探討NRG1-BMSCs 的神經保護作用及分子機制。