血清TLR4 和PTEN 與特發性膜性腎病患者臨床病理特征及預后的相關性

鐘嬌影 劉慧 陳秀娟 蘇寶印 朱昭明 劉杰

膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）是一種影響腎小球毛細血管壁的疾病，約占成人腎病綜合征病例的20%［1］。特發性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropathy，IMN）約 占MN 的80%，其主要臨床特征是不同程度的蛋白尿，是腎衰竭的主要原因之一，會給患者及家庭帶來極大身心傷害和經濟負擔［2-3］。Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是脂多糖的經典病原體識別受體，在先天性免疫系統中起關鍵作用，且已有研究報道TLR4 通過激活免疫炎癥反應，在腎病中發揮作用［4-5］。第10 號染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homologuedeleted chromosome ten gene，PTEN）是一種腫瘤抑制因子，近年來有研究顯示，腎損傷患者中的PTEN 水平受到動態調節，PTEN 可能在腎臟疾病中起重要作用［6-7］。目 前關 于TLR4 和PTEN 在IMN 中的研究報道還較為鮮見，對于兩者在IMN中的作用機制還有待進一步探索。本研究將分析其與IMN 患者臨床病理特征及預后的關系，為IMN 的預后評估提供一定參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取于2019 年1 月至2022 年1 月在河北以嶺醫院就診治療的IMN 患者224 例為IMN 組研究對象，男144 例、女80 例，平均年齡（54.38±5.72）歲；另選取同期在本院體檢健康者100 名作為對照組研究對象，男54 例、女46 例，平均年齡（53.85±5.69）歲。

納入標準：①所有患者均經腎組織活檢確診［8］；②就診前無激素和免疫抑制劑服用史；③臨床資料完整；④患者及家屬知情且同意。排除標準：①惡性腫瘤、感染性疾病、免疫系統疾病、血液系統疾病以及代謝性疾病患者；②患有其它腎小球疾病者；③隨訪時間不足12 個月者；④妊娠期和哺乳期女性。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集

采集IMN 患者確診當日和對照組體檢當日清晨空腹靜脈血3 mL，離心機（德國Sigma 公司，型號：SIGMA 8KS）常溫條件下5 000 r/min 離心8 min，離心半徑10 cm，取上清液，-80℃冰箱超低溫保存備用。

1.2.2 酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清TLR4、PTEN 水平

根據人TLR4 ELISA 試劑盒（上海名勁生物，貨號：B1468）、人PTEN ELISA 試劑盒（上海欽誠生物，貨號：QC6296-A）說明書配制TLR4、PTEN 標準品溶液，解凍血清樣本，多功能酶標儀（上海閃譜，型號：SuPerMax 3000FA 型）測定TLR4、PTEN 標準品溶液及血清樣本在450 nm處的吸光度。

1.2.3 IMN 患者臨床指標測定及收集

收集IMN 患者腎組織穿刺活檢病理資料，包括IMN 分期［9］、腎小球硬化、腎小管間質損害情況。采用全自動生化分析儀（南京普朗醫療，型號：PUZS-600A）測定患者24 h 尿蛋白、總膽固醇、甘油三酯、血肌酐、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）生化指標。

1.2.4 隨訪及預后評估

對IMN 患者進行為期12 個月的隨訪調查，隨訪截止至2023 年1 月，評估患者預后情況［10］，分為完全緩解：24 h 尿蛋白＜0.3 g，血清白蛋白＞25 g/L，腎小球濾過率下降＜15%，且、血肌酐水平正常；部分緩解：24 h 尿蛋白定量＜3.5 g，腎小球濾過率下降＜15%，且血肌酐水平基本正常；未緩解：不符合完全緩解和部分緩解標準者。根據隨訪結果將IMN 患者分為預后良好組174 例和預后不良組50例，預后良好組指完全緩解和部分緩解患者，預后不良組指未緩解患者。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 對數據進行統計分析。計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；計量資料滿足正態分布和方差齊性以（）表示，采用t檢驗；采用pearson 分析IMN 患者血清TLR4 水平和PTEN 水平相關性；采用多因素Logistic 回歸分析IMN 患者預后不良的影響因素；采用受試者工作特征曲線（ROC）分析血清TLR4 和PTEN 在評估IMN 患者預后中的價值。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組與IMN 組血清TLR4、PTEN 水平比較

與對照組相比較，IMN 組血清TLR4、PTEN 水平均顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組血清TLR4、PTEN 水平比較（）Table 1 Comparison of serum TLR4 and PTEN levels between 2 groups（）

表1 兩組血清TLR4、PTEN 水平比較（）Table 1 Comparison of serum TLR4 and PTEN levels between 2 groups（）

2.2 不同預后IMN 患者血清TLR4、PTEN 水平比較

與預后良好組相比較，預后不良組血清TLR4、PTEN 水平均顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 不同預后IMN患者組血清TLR4、PTEN水平比較（）Table 2 Comparison of serum TLR4 and PTEN levels in IMN patients with different prognosis（）

表2 不同預后IMN患者組血清TLR4、PTEN水平比較（）Table 2 Comparison of serum TLR4 and PTEN levels in IMN patients with different prognosis（）

2.3 不同預后IMN 患者臨床病理特征比較

與預后良好組相比較，預后不良組血肌酐、IgG 水平均顯著上調，IMN 分期中Ⅲ期和Ⅳ期概率顯著提高，Ⅰ期和Ⅱ期概率顯著降低，腎小球硬化、腎小管間質損害概率及高血壓、糖尿病患者比例顯著提高（P＜0.05）；兩組間的性別、年齡、體質指數、是否有吸煙史、24 h 尿蛋白、總膽固醇、三酰甘油水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同預后IMN 患者臨床病理特征比較［n（%），（）］Table 3 Comparison of clinicopathological characteristics of patients with different prognosis of IMN［n（%），（）］

表3 不同預后IMN 患者臨床病理特征比較［n（%），（）］Table 3 Comparison of clinicopathological characteristics of patients with different prognosis of IMN［n（%），（）］

2.4 IMN 患者血清TLR4 與PTEN 水平相關性分析

pearson 相關分析結果顯示，IMN 患者血清TLR4 與PTEN 水平呈正相關（r=0.504，P＜0.05）。

2.5 多因素Logistic 回歸分析IMN 患者預后不良的影響因素

多因素Logistic 回歸分析結果顯示，TLR4、PTEN、IgG、合并高血壓均為IMN 患者預后不良的獨立危險因素（P＜0.05）。見表4、5。

表4 多因素Logistic 回歸分析因變量和自變量賦值Table 4 Assignment of Dependent and Independent Variables in Multifactor Logistic Regression Analysis

表5 多因素Logistic 回歸分析IMN 患者預后不良的影響因素Table 4 Multifactorial logistic regression analysis of factors influencing poor prognosis in IMN patients

2.6 血清TLR4、PTEN 水平在預測IMN 患者不良預后中的價值

以血清TLR4、PTEN 水平為檢驗變量，以IMN患者預后是否不良為狀態變量（是=1，否=0）繪制ROC 曲線。結果顯示血清TLR4、PTEN 聯合預測IMN 患者預后是否不良的AUC 為0.941，高于兩者單獨預測（P＜0.05）。見表6、圖1。

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curves

表6 TLR4、PTEN 水平對IMN 患者預后不良的預測效能分析Table 6 Analysis of the predictive efficacy of TLR4 and PTEN levels on poor prognosis in IMN patients

3 討論

目前認為IMN 是由靶向足細胞的IgG 引起的，IgG 與抗原結合和補體活化形成的膜攻擊復合物，是認識膜性腎病發病機制的主要依據［1-2］。本研究結果與高玉偉等［11］研究結果相似。

TLR4 介導的先天性免疫應答具有雙重功能，當TLR4 過度激活或其負調節系統受阻時，TLR4可誘發內毒性休克，自身免疫性疾病，甚至細胞因子風暴，免疫系統攻擊宿主［12］。研究顯示，TLR4通過影響足細胞凋亡對膜性腎病進展的影響，且TLR4 參與急性和慢性腎臟疾病的發病機制，如急性腎損傷、腎纖維化和糖尿病腎臟?。?3］。在MN患者腎組織中，TLR4 的表達顯著上調，血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）通過提高TLR4 表達水平促進足細胞凋亡［5］。本研究發現，IMN 組血清TLR4 水平較對照組顯著升高，與Jin 等［5］在MN患者中的研究結果相似，TLR4 可能通過促進足細胞凋亡促進IMN 進展［1］。

PTEN 蛋白磷酸酶可去磷酸化多種底物，在細胞功能中發揮多種作用，包括抑制細胞粘附和遷移以及維持基因組完整性［14］。研究顯示，PTEN 可通過不同信號途徑影響腎臟纖維化進程。miR-21通過靶向PTEN，激活成纖維細胞，促進腎纖維化，PTEN 通過誘導上皮-間充質轉化驅動糖尿病腎?。?5］。本研究發現，IMN 組血清PTEN 水平較對照組顯著升高，與Wu 等［16］研究結果一致。另外，本研究結果顯示預后不良組血清TLR4 和PTEN水平升高，且TLR4 和PTEN 為IMN 患者預后不良的獨立危險因素，提示TLR4 和PTEN 水平過高的IMN 患者病情更為嚴重，其預后不良的概率較大。進一步研究發現，IMN 患者血清TLR4 水平與PTEN 水平呈正相關，推測TLR4 與PTEN 共同參與IMN 的發生發展，PTEN 通過與TLR4 相互作用激活，進而通過調控磷脂酰肌醇-3-激酶依賴性信號轉導誘導足細胞凋亡，進而驅動IMN 的發生，二者可能是IMN 的潛在調控因子［2，17］。TLR4、PTEN聯合預測IMN 患者預后是否不良的AUC 為0.941，高于兩者單獨預測，且特異度為89.08%，靈敏度為88.00%，提示TLR4 與PTEN 聯合在預測IMN 患者預后中具有重要價值。

IMN 患者血清TLR4、PTEN 水平較對照組顯著升高，且預后不良患者TLR4、PTEN 水平顯著高于預后良好患者，IMN 患者預后與其臨床病理特征具有一定相關性，且TLR4、PTEN 在預測IMN患者預后中具有一定價值。本研究樣本數量有限，可擴大樣本對此進行進一步驗證。