基于穩定同位素內標的高效液相色譜串聯質譜法測定乳制品中L-巖藻糖的含量

楊倩倩 何姝 曹晶

DOI：?10.3969/J.ISSN.1000-5137.2024.01.005

收稿日期：?2023-11-01

基金項目：?上海市科技創新行動計劃（20JC1416800）

作者簡介：?楊倩倩（1999—），?女，?碩士研究生，?主要從事食品檢驗檢測和分析等方面的研究. E-mail：?1730813139@qq.com

* 通信作者：?曹?晶（1981—），?女，?副研究員，?主要從事食品檢驗檢測和分析等方面的研究. E-mail：?caojing@shnu.edu.cn

引用格式：?楊倩倩，?何姝，?曹晶. 基于穩定同位素內標的高效液相色譜串聯質譜法測定乳制品中L-巖藻糖的含量?［J］.上海師范大學學報?（自然科學版中英文），?2024，53（1）：35?43.

Citation format：?YANG Q Q，?HE S，CAO J. Determination of L-fucose content in dairy products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with stable isotope internal standard ［J］. Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），?2024，53（1）：35?43.

摘??要：?基于穩定同位素內標（SIIS），構建了一種簡單的乳制品前處理方法，將乳制品中的L-巖藻糖（L-Fuc）高效地游離出來，利用高效液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）建立了乳制品中L-巖藻糖含量的定量測定方法. 首次引入SIIS來定量乳制品中的L-巖藻糖，采用電噴霧離子源（ESI）負離子掃描模式和多重反應監測（MRM）模式進行定量分析. 研究過程中對質譜鑒定、色譜條件、樣品前處理過程都進行了方法的比較優化，并檢測了純牛奶、酸奶等5種乳制品中L-巖藻糖的含量. L-巖藻糖在0.001～1.000 ?g·mL-1范圍內線性關系良好，相關系數為0.999 99，樣品加標回收率在71.67%～117.27%之間，相對標準偏差（RSD）在2.00%～9.64%之間，檢出限為0.1 ng·mL-1，定量限為0.5 ng·mL-1. 該方法樣品前處理簡單，靈敏度高，檢測結果準確，可定量不同乳制品中L-巖藻糖的含量，為其他領域中L-巖藻糖含量的測定提供了可借鑒的方法.

關鍵詞：?L-巖藻糖（L-Fuc）；?穩定同位素內標（SIIS）；?液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）；?多重反應監測（MRM）；?乳制品

中圖分類號：?O 65 ???文獻標志碼：?A ???文章編號：?1000-5137（2024）01-0035-09

Abstract：?Based on the stable isotope internal standard（SIIS），?a simple dairy pretreatment method was established to efficiently separate the L-fucose（L-Fuc）?from dairy products. A quantitative method for L-fucose content in dairy products was established using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）. SIIS coupled with LC-MS/MS to quantify L-fucose was employed for the first time. The method used electronic spray ionization（ESI）?mode and multi reaction monitoring（MRM）?mode for quantitative analysis. During the study，?the mass spectrometric identification，?chromatographic conditions，?and sample preparation were optimized，?and the content of L-fucose in five kinds of dairy products，?such as pure milk and yogurt，?was detected. The results showed that the linear range of L-fucose was 0.001-1.000 ?g·mL-1，?and the correlation coefficient was 0.999 99. The recoveries were 71.67%-117.27%，?and the relative standard deviations（RSD）?were 2.00%-9.64%. The limit of detection was 0.1 ng·mL-1，?and the limit of quantification was 0.5 ng·mL-1. This method has the advantages of simple sample preparation，?high sensitivity，?accurate detection results，?and can be used to quantify the L-fucose in different dairy products. It provides a reference method for the determination of L-fucose content in other fields.

Key words：?L-fucose（L-Fuc）；?stable isotope internal standard（SIIS）；?liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）；?multi reaction monitoring（MRM）；?dairy products

0 ?引?言

巖藻糖（Fuc）是六碳糖的一種，又稱6-脫氧-L-半乳糖，也可以看作是一種甲基戊糖. 自然界中的巖藻糖絕大多數為L-巖藻糖（L-Fuc），D構型的巖藻糖僅作為一種稀有糖發現于一些糖苷類化合物中. L-巖藻糖是一種特殊的單糖，存在于哺乳動物細胞產生的各種糖脂和糖蛋白中，與一般的六碳糖相比，巖藻糖獨特之處在于其結構上在六號碳原子處少一個羥基，所以巖藻糖具有L構型，而哺乳動物中所有其他天然存在的糖都以D構型的結構存在［1-3］. L-巖藻糖在某些血型物質分子中是一定的血型標記物，同時也是人乳、牛乳中的單糖之一，具有消炎、抗凝血、抗腫瘤、抗癌、抗獲得性免疫缺陷綜合征等功效［4-7］. 由于牛乳中的L-巖藻糖含量很低，人們可以結合對L-巖藻糖的認識，將其添加至乳飲品中提高食品的營養價值，作為理想的膳食補充劑和幼兒的營養補充劑［8］.

目前，對L-巖藻糖含量的測定方法有比色法［9-10］、離子色譜法［11-12］、氣相色譜法［13］、高效液相色譜法［14-21］、高效液相色譜-串聯質譜法［22-24］等. 比色法易受到其他可與顯色試劑反應的物質的干擾；離子色譜法檢測用時長且準確性低；氣相色譜法必須將單糖衍生化才能進行分析，步驟繁瑣；高效液相色譜法主要分為直接測定法［14-15］和柱前衍生法［16-19］兩種方法. 直接測定法常采用蒸發光散射檢測器（ELSD）［14］或示差折光檢測器（RID）［15］，RID對環境溫度的穩定性要求較高，且靈敏度低，ELSD靈敏度比RID稍高，但仍不理想. 柱前衍生法需要用紫外［20］或熒光［21］試劑對單糖進行衍生，使其能夠被檢測，操作繁瑣且常出現異常干擾，影響分析的準確性. 液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS）中質譜的靈敏度較高，且具有分離鑒定同時進行的優點，與常用檢測器相比較，質譜作為檢測器時根據其提供的相對分子質量和子離子信息以及子離子所對應的質譜圖，可以更快更準確地定性與定量［24］，但該方法仍受到基質效應的限制. 因此，本研究擬開發一種高效游離L-巖藻糖的前處理方法，基于LC-MS/MS法，引入穩定同位素內標（SIIS）L-［UL-13C6］Fucose，利用其與待測物有相似的理化性質來消除樣品中的基質干擾，提高檢測的準確性，定量不同乳制品中L-巖藻糖的含量.

1 ?材料與方法

1.1 儀??器

Ultivo高效液相色譜三重四極桿質譜聯用儀，美國Agilent公司；BSA224S電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；LP漩渦振蕩器，美國Thermo公司；Centrifuge-V醫用離心機，賽默飛世爾儀器有限公司；SB-3200 DTD超聲波水浴，寧波新芝生物科技股份有限公司；JXH-100恒溫混勻儀，上海凈信實業發展有限公司；Millipore超純水凈化器，美國MILLIPORE公司.

1.2 試??劑

純牛奶、酸奶、脫脂高鈣奶粉、全脂高鈣奶粉、奶酪均購于本地超市；甲酸，LC-MS級，賽默飛公司；乙酸，質量分數為99.5%，東京化成工業株式會社；乙酸銨，質量分數為99%，北京百靈威科技有限公司；乙腈，質量分數為99%，賽默飛公司；L-巖藻糖，質量分數為99%，上海賢鼎生物科技有限公司；L-巖藻糖的同位素化合物L-［UL-13C6］Fucose，質量分數為95%，上海賽爾斯生化科技有限公司；實驗用水均為超純水.

1.3 標準溶液的配制

精確稱取L-巖藻糖標準品10 mg，用超純水配制成1 mg·mL-1的標準儲備液，于-20 ℃下儲存備用.

將1 mg的L-［UL-13C6］Fucose同位素標準品用超純水配制成1 mg·mL-1的內標標準儲備液，于-20 ℃下儲存備用.

混合內標標準工作液的制備：精確移取一定量的標準儲備液和內標標準儲備液用超純水逐級稀釋成1.000，0.500，0.250，0.050，0.025，0.005和0.001 ?g·mL-1的L-巖藻糖標準工作液，其中內標質量濃度均為0.05 ?g·mL-1，于4 ℃下儲存備用.

1.4 樣品前處理

精密稱取20 mg（精確至0.1 mg）實際樣品于離心管中，加入1 mL體積分數為50%的乙酸水溶液，振蕩混勻，水浴超聲10 min，使樣品充分溶解. 在恒溫混勻儀中50 ℃下反應1 h，酸解后冷卻至室溫，離心2次（15 000 r·min-1，10 min）. 離心后取下層清液稀釋100倍，并加入內標標準工作液，使其質量濃度與混合標準工作液中內標濃度一致（為0.05 ?g·mL-1）. 接著用超濾管14 000g離心10 min，過0.22 ?m的水系濾膜，上機待測.

1.5 實驗條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.8 ?m）；柱溫：25 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：1 ?L；流動相：0.05%（體積分數）甲酸水溶液（流動相A），0.05%（體積分數）甲酸的乙腈溶液（流動相B），流動相梯度洗脫程序見表1.

1.5.2 質譜條件

ESI掃描模式：負離子模式（ESI-）；質譜檢測方式：MRM；毛細管電壓：3 000 V；噴嘴電壓：500 V；碰撞能量（CE）：9 V；裂解電壓：77 V；鞘氣流量：11 L·min-1；鞘氣溫度：325 ℃；霧化器壓力：30 psi；干燥器流量：7 L·min-1；干燥器溫度：250 ℃；MRM參數見表2.

2 ?結果與討論

2.1 質譜條件的選擇和優化

實驗通過針泵進樣，分別在電噴霧正離子和負離子掃描模式下對10 ?g/mL（質量濃度）的L-巖藻糖標準溶液和內標標準溶液進行母離子全掃描，結果表明，負離子模式下的信噪比高于正離子模式，基線更平穩，背景干擾峰少，因此實驗選擇負離子掃描模式. 在ESI-模式下，確定L-巖藻糖與內標的母離子的質荷比（m/z）分別是163.1和169.1，接著以這2個母離子進行子離子掃描，得到L-巖藻糖和內標的二級質譜主要特征碎片離子的質荷比分別是58.8*，89.1和61.2*，92.5，如圖1所示. 在ESI-和MRM模式下優化CE與裂解電壓，使母離子與特征碎片離子產生的離子對相對強度達到最大，以提高檢測的靈敏度，優化后的質譜參數見表2.

圖1 （a）?L-巖藻糖和（b）?內標的子離子掃描質譜圖

基于LC-MS/MS檢測樣品中的待測物時，樣品中的一些共同提取物可能會產生基質效應，使待測物的響應信號增強或抑制，影響分析結果的準確性. 因此，為最大限度地降低基質效應，選擇了一種同位素標記內標L-［UL-13C6］Fucose，在預處理前加入待測樣品中，由于其與待測物L-巖藻糖的物理化學性質類似，有著相同的色譜保留時間、斷裂模式、離子化效率，當內標和待測物的響應信號受到同樣程度的抑制或增強時，任何離子化條件的改變只會影響絕對的峰面積，而待測物與內標的比值不會受到影響，因此，同位素標記法既可以抵消基質效應的影響，又能校正樣品前處理過程中的誤差，使分析結果更準確，如圖2所示.

圖2 混合內標與L-巖藻糖的MRM質譜圖

2.2 色譜條件的選擇和優化

2.2.1 色譜柱的選擇

圖3 （a）?HILIC （150 mm）?Column和（b）?C18 （150 mm）?Column的MRM色譜圖

測定單糖時常選用C18色譜柱，鑒于L-巖藻糖富含羥基，屬于親水化合物，該研究比較了Eclipse Plus C18 Column（150 mm×2.1 mm，1.8 ?m）和Poroshell 120 HILIC Column（150 mm×2.1 mm，2.7 ?m）這2種色譜柱［25］. 結果表明：與HILIC Column 相比，C18 Column的分離效果更佳，峰形良好，峰面積更大，因此選擇C18 Column，如圖3所示. 由于L-巖藻糖多羥基，極性較大，出峰時間早，因此實驗最終選擇50 mm的Eclipse Plus C18 Column用于后續樣品的測定來縮短檢測時間和提高分析效率，如圖4所示.

圖4 C18 （50 mm）?Column的MRM色譜圖

2.2.2 流動相添加劑的選擇

由于L-巖藻糖的極性較大，通常選擇乙腈與水作為流動相，在流動相中有無添加劑也會影響樣品的分離度與分析的靈敏度. 選擇C18 Column后，在ESI-模式下考察了5 mmol·L-1乙酸銨的水溶液/乙腈溶液，0.05%（體積分數）甲酸的水溶液/乙腈溶液這2種流動相對分離的影響. 結果表明：添加劑為甲酸時，背景噪聲小，基線更平穩，如圖5所示，故選擇0.05%（體積分數）甲酸的水溶液/乙腈溶液作為流動相，優化后的流動相梯度洗脫程序見表1.

圖5 （a）5 mmol·L-1乙酸銨的水溶液/乙腈溶液和（b）0.05%甲酸的水溶液/乙腈溶液的流動相優化

2.3 樣品前處理優化

乳制品是一種復雜的混合物，主要以脂質、蛋白質、低聚糖、維生素等其他生物活性物質組成［26］，而L-巖藻糖主要以巖藻基化的形式存在于乳制品中，因此，測定L-巖藻糖含量前需對樣品中的低聚糖進行水解. 通常水解低聚糖的方式有2種：酸解和酶解，但酶解不僅對底物性質、反應溫度要求嚴格，而且水解不完全，故本實驗采用酸解法. 目前已報道的酸解法有：鹽酸水解法、濃硫酸水解法、三氟乙酸水解法和乙酸水解法等［27］. 鹽酸通常用于糖蛋白和含氨基脫氧糖的水解，在密閉環境中的高溫條件下有氧化性和強酸性，易對低聚糖造成破壞. 硫酸主要用于水解中性糖，水解時需要嚴格控制硫酸的濃度，濃度過高易引起糖炭化. 三氟乙酸常用于植物細胞壁多糖、糖蛋白及糖胺聚糖的水解，在高溫條件下具有氧化性且其毒性大. 經過多次對比實驗，該研究最終選用體積分數為50%的乙酸水溶液作為水解酸，既能最低程度破壞L-巖藻糖，又能較好地將L-巖藻糖水解游離出來. 由于酸解過程中不可避免地會對單糖造成一定的破壞，導致測定結果偏低，若酸解不完全，又無法進行準確的定量分析，因此選擇合適的酸解條件至關重要. 該實驗對酸解溫度（40，50，60，70，80，90 ℃）與酸解時間（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h）進行了考察，最終確定最佳的酸解溫度為50 ℃，酸解時間為1.0 h.

樣品以優化后的酸解條件處理后，實驗采用了超濾法（超濾膜，0.22 ?m水系濾膜）對得到的L-巖藻糖粗品進行預分離純化，除去樣品中的蛋白質等大分子雜質. 超濾法預分離純化樣品時操作簡便，分離效率高且條件溫和，無成分破壞.

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線、檢出限與定量限

L-巖藻糖標準工作液系列質量濃度為0.001，0.005，0.025，0.050，0.250，0.500和1.000 ?g·mL-1，同位素內標質量濃度為0.050 ?g·mL-1. 以L-巖藻糖標準品的質量濃度（X）為橫坐標，L-巖藻糖標準品與同位素內標峰面積的比值（Y）為縱坐標繪制標準曲線. 結果顯示：在0.001～1.000 ?g·mL-1范圍內線性良好，相關系數（R2）為0.999 99. 以信噪比S/N≥3的計算方法得出檢出限為0.1 ng·mL-1，以S/N≥10的計算方法得出定量限為0.5 ng·mL-1. 該方法的靈敏度可以滿足乳制品中L-巖藻糖的檢測要求.

圖6 L-巖藻糖的標準曲線

2.4.2 加標回收率與精密度

精密稱取實際樣品20 mg，按照所建立的方法處理后進行測定. 依次在原含量樣品的基礎上分別添加0.025，0.050和0.250 ?g·mL-1的L-巖藻糖標準品，在優化后的實驗條件下，每個加標樣品與空白樣品均重復進樣6次（n=6），計算加標回收率，結果見表3. 該方法的平均回收率為71.67%～117.27%，回收率較高；相對標準偏差（RSD）為2.00%～9.64%，精密度良好.

2.5 實際樣品測定

將本地超市所購買的純牛奶、酸奶等5種乳制品按1.4節樣品前處理后，應用1.5節實驗方法進樣，測定樣品中L-巖藻糖的含量，測定結果如表4所示.

3 ?結?論

該研究建立了一種基于SIIS的LC-MS/MS測定乳制品中L-巖藻糖含量的分析方法. 該方法樣品前處理過程簡捷，分析效率高，實驗結果的重現性與精密度好，靈敏度高，能滿足乳制品中L-巖藻糖的檢測要求. 同時，首次引入了SIIS，最大限度地降低了基質效應的影響，使分析結果更準確. 因此，該方法可準確地定量乳制品中L-巖藻糖的含量，為乳制品的生產質量把控和質量鑒定提供有效的手段，并為其他領域中L-巖藻糖含量的測定提供可借鑒的方法. 例如，人尿液中的L-巖藻糖是一種常見的癌癥臨床生物標志物，因此，對L-巖藻糖含量的準確測定是至關重要的. 為深入了解L-巖藻糖的生物功能，眾多臨床研究者經過幾十年的努力已經探索出了多種測定L-巖藻糖含量的分析方法，其中，應用最廣泛的檢測方法就是LC-MS/MS. 然而，實際樣品中的成分極其復雜，大多數存在于實際樣品中的該類生物分子由于基質效應的作用導致質譜響應信號較低，難以對低豐度的實際樣品進行定量分析. 因此，還需進一步對該類生物分子進行有效的分離富集以增強檢測的靈敏度，并將該方法應用于生物醫學等領域，為臨床生物標志物的檢測提供參考.

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（責任編輯：郁慧，顧浩然）