谷子DUS 測試標準品種指紋圖譜的構建與應用

史慎奎 　祁東梅　王春芳　王玉芳　蔡爽

摘要：谷子遺傳資源多樣性的研究對谷子基礎研究與育種實踐具有重要意義。選擇高質量的SSR 標記對DUS（Distinctness-特異性、Uniformity-一致性和Stability-穩定性）測試標準品種進行遺傳多樣性分析，不僅能夠解析標準品種的遺傳信息，也有助于對新育成品系進行分子水平的遺傳多樣性分析。研究利用高質量的20 個SSR標記對30 份不同地理來源的谷子DUS 測試標準品種進行遺傳多樣性分析，并構建其指紋圖譜；同時，利用該指紋圖譜的SSR 標記對22 份春谷區和30 份夏谷區區試品種進行遺傳多樣性分析，旨在為谷子品種資源利用與遺傳改良奠定理論基礎。結果表明，20 對SSR 標記在DUS 測試品種平均每對引物檢出的等位變異數為9.15 個，20 個位點的平均多態性信息含量（PIC）為0.77。利用上述SSR 標記對來自春谷區與夏谷區的共計52 份谷子區試品種進行分子鑒定，春谷區的聚類分析結果顯示，22 份春谷區區試品種分為3 個主要的類群；而夏谷區的聚類分析結果顯示，30 份谷子夏谷區區試品種分為4 個類群，但難以區分春谷、夏谷區區試品種。研究結果厘清了谷子DUS 測試標準品種和區試品系間的遺傳相似性。

關鍵詞：谷子；指紋圖譜；遺傳多樣性；DUS 測試；區試品種

中圖分類號：S515 文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2024）01?0010?09

谷子是我國北方旱作農業區重要的特色作物之一，距今已有8 700 a 的栽培歷史。其具有優良的抗旱、節水特性，是旱地農業的穩產作物，也是應對未來干旱形勢的戰略儲備作物[1-2]。我國是谷子的起源中心，谷子種質資源的遺傳多樣性豐富[3]。因此，利用分子標記技術構建指紋圖譜，并研究谷子的遺傳多樣性，有助于谷子遺傳基礎的解析與種質資源的有效利用，對谷子的種質資源創新與遺傳改良具有重要意義[4-7]。

SSR（Simple sequence repeat）標記由于其在基因組間分布廣泛，表現出共顯性與重復性好、多態性高、擴增結果穩定、檢測手段簡便等優勢，從而被廣泛應用于作物品種資源的指紋圖譜構建、遺傳關系分析等研究[8-9]。JIA 等[10]利用自主開發的15 個EST-SSR 標記對12 份谷子進行遺傳多樣性分析，其中，4 個標記表現出多態性，共檢測到10 個等位變異，由于EST-SSR 標記的多態性豐富性較差，不適于作遺傳多樣性分析。賈小平等[11]利用37 個SSR 標記在來自中國、印度和俄羅斯的共計40 份谷子品種中共檢測出228 個等位變異，平均等位變異位點為6.16 個，多態性信息含量（PIC）為0.697，顯示了SSR 標記在分析谷子遺傳變異方面的有效性。對于目前谷子DUS 測試標準品種來說還未從分子標記水平上進行遺傳多樣性分析，也未篩選出一套用于標準品種和區試品種的較為高效應用性SSR 標記。

本研究使用篩選到的20 個高質量的SSR 標記對30 份谷子DUS 測試標準品種進行指紋圖譜的構建，同時對來自春谷區和夏谷區的52 份區試品種進行遺傳多樣性分析，以期能夠為區試材料的遺傳相似性分析和后續參加DUS 測試奠定基礎，亦能夠為谷子品種資源管理與利用、育種實踐、品種審定及新品種保護等方面提供一定的科學依據與技術基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究利用30 份谷子DUS 測試品種（表1）構建DNA 指紋圖譜，并利用該指紋圖譜對22 份春谷區試品種和30 份夏谷區試品種進行遺傳多樣性檢測（表2）。

1.2 基因型檢測

采用CTAB 法提取谷子基因組DNA，使用紫外分光光度法測定DNA 濃度，稀釋至20 μg/L。PCR 擴增反應在eppendorf 公司PCR 儀上進行，反應總體積為20 μL，包括DNA 模板（20 ng/μL）2 μL，2×Es TaqMasterMix 10 μL，正反向引物各1 μL，去離子水6 μL。擴增產物在6% 變性聚丙烯酰胺凝膠以50 W 恒功率電泳分離，用硝酸銀法對凝膠進行染色、顯影并拍照。

本研究選用20 個SSR 標記進行指紋圖譜構建與遺傳多樣性檢測，所有SSR 標記分布在谷子的1～9 號染色體上（表3）[11]。

1.3 數據統計與分析

用Excel 的形式，將清晰的條帶轉換成數字形式，形成“01”矩陣（要求：無擴增條帶記為“0”，有擴增條帶記為“1”）[12-13]。通過POPGENE V1.32[14]和Powermarker[15]軟件來分析基因型數據，從而獲得SSR 標記位點的有效等位變異數（Ne）、香農-韋弗（Shannon-Weaver）指數（I）、觀測核苷酸雜合度（Ho）、期望核苷酸雜合度（He）、Nei?s 多樣性指數以及等位變異數Na[15]。通過NTSYS（Version 2.10e）軟件來分析基因型數據，從而獲得30 份谷子DUS測試品種的指紋圖譜以及區試品種間遺傳關系的聚類圖[16]。

2 結果與分析

2.1 DUS 測試品種指紋圖譜構建與遺傳多樣性分析

本研究使用的20 個SSR 標記覆蓋谷子全基因組的9 條染色體，每條染色體的標記數量為2～3 個。SSR 引物在谷子DUS 測試品種中的擴增結果顯示，全部引物在多數材料中均能實現穩定、清晰的擴增，例如，p80 和b165 在30 份谷子材料中僅有1 份材料未能實現有效擴增，其余材料均能有效擴增（圖1），分別檢測出等位位點4 個和6 個，所有SSR 標記多態性信息含量（PIC）分別為0.65 和0.73，b185 的PIC 值最低，為0.47，共測出等位位點數5 個，而b247 共檢測出等位位點數15 個，PIC 值最高，為0.91（表4）。

每個標記檢測出的等位變異數為5～15 個，平均每個位點檢測出的等位變異數為9.15 個，每個位點獲得有效等位變異數（Ne）為2.1～12.2 個，香農-韋弗（Shannon-Weaver）指數（I）分布范圍為1.00～2.59，所有SSR 標記多態性信息含量（PIC）為0.47～0.91，平均值為0.77（表4）。

使用其中20 對SSR 標記即可對30 份谷子DUS 測試品種進行指紋圖譜構建，結果表明，僅用前16 個SSR 標記即可將30 份谷子品種進行區別鑒定（圖2）。

進一步對DUS 測試品種進行遺傳聚類分析，結果顯示（圖3），可以將30 份品種分為兩大類群，類群I 包括粱谷等19 份品種，類群Ⅱ包括佛手水等11 份品種；30 份谷子DUS 標準品種間遺傳相似系數（genetic similarity，GS）值變動于0.82～0.97，其中I 組內遺傳相似度最高的2 個品種為W67 與紅十里香，II 組內遺傳相似程度最高的為2 個農家品種貓蹄谷與兔蹄谷。

2.2 指紋圖譜的應用

利用上述構建DUS 測試品種指紋圖譜的分布在谷子不同染色體上的20 個SSR 標記，對春谷區試品種和夏谷區試品種進行遺傳多樣性分析。首先對全部春谷區和夏谷區區試品種52 份材料進行整體聚類分析，未見其明顯分為兩大類，也暗示春谷區材料和夏谷區材料之間具有共同的遺傳基礎，可能與跨生態區域的種質資源交流較為頻繁有關（圖4）。

進一步對22 份春谷區區試品種聚類，分為3 個主要的類群，即I、II 和III（圖5-A），I 組包括2 個品系200732-1 與龍11-7004，III 組包括長農40 號、長農43 號、長農44 號、太選14 號和太選16 號等5 個品種，均為來自山西的品系；II 組中包括15 個品系，甘肅的2 個品系遺傳相似度最高，與農家品系綠香谷親緣關系較近；2 個農家品系黃旗谷和峰紅谷遺傳相似度較高，與育成品種承谷9 號遺傳關系較近；來自東北的品系如吉2050、朝谷58、朝雜谷1 號等與來自山西的品系聚在一起。

夏谷區的聚類分析顯示，30 份夏谷區區試品種分為4 個類群，即I、II、III 和IV（圖5-B），其中I 組包括7 個品系，II 組包括4 個品系，III 組包括5 個品系，IV 組包括14 個品系。遺傳相似度最高的為來自保定的2 個品系保200302 和保213，其次是鄭07-1 與滄372、晉谷28 號與冀谷25 和M1508 和航谷8 號相似度較高。

3 結論與討論

谷子育成品種的遺傳多樣性分析是發掘谷子遺傳改良的基礎[2]，對谷子DUS 測試品種的遺傳多樣性分析有利于對其遺傳基礎的剖析[13，17]，也有助于DUS 測試品種的應用。本研究選用20 對分布于谷子9 條染色體上的SSR 引物對30 份不同地理來源的谷子DUS 測試品種進行分析，構建了谷子的指紋圖譜。每個標記檢測出的等位變異數為5～15 個，平均每個位點檢測出的等位變異數為9.15 個，平均PIC 為0.77。本研究結果略低于朱學海等[18]報道的用21 個SSR 標記對120 個谷子品種進行鑒定，其檢測出的平均等位變異數為14.5 個/位點，平均PIC 值為0.809 的結果，但高于賈小平等[11]報道的用37 個SSR 標記檢測40 個谷子品種，其檢測出的平均等位變異數為6.16 個/位點，平均PIC值為0.697 的結果；同時遠高于JIA 等[10] 用15 個SSR 標記對12 個谷子品種進行鑒定，發現其平均等位變異數為2.5 個/位點，也高于楊天育等[4]報道的用60 對引物檢測來自我國北部高原生態區的20 個谷子品種，其檢測出的平均等位變異數為2.71 個/位點。產生這一結果的原因之一可能是DUS 測試品種存在較大的地理來源差異，另外，也可能是由于使用的SSR 標記具有豐富的遺傳變異，造成在DUS 測試品種的指紋圖譜構建中發現的谷子遺傳多樣性較高[19]。

基于20 個SSR 標記分析的春谷區與夏谷區區試品種的遺傳相似性和聚類分析結果顯示，春谷區22 份區試品種聚成三大類，其中C 組來自山西的品種聚在一起，說明該組品種的培育存在地域性，可能的原因是目前在育種過程中針對關鍵育種材料使用頻率較高，尤其是對谷子種質資源中重點骨干親本利用過于集中，造成在特定生態區域內新育成的谷子品種（品系）遺傳背景較相似，遺傳相似程度較高，遺傳多樣性降低[2]。針對夏谷區30 份區試品種的鑒定發現，不同地理來源的品種聚在一起，可能的原因是由于不同的育種單位之間存在的育種材料的交流與共享，說明在夏谷區的育種過程中對資源的利用程度與品種資源的交流比較頻繁[15]。因此，在利用SSR 標記對谷子品種進行遺傳多樣性分析的同時，還需要更多方面的證據包括農藝性狀方面的多態性鑒定，才能更清晰的了解所鑒定的谷子品種的遺傳構成，也為谷子品種資源的利用提供支持[16，19-20]。

目前，利用SSR 指紋圖譜對品種鑒定和分析的方法已經在谷子常規品種中研究與應用較多[13，21]。本研究首次將此方法用在谷子DUS 測試品種與區試品系分子鑒定中，發現利用16 個SSR 標記可將30 份谷子DUS 測試品種成功區分開，表明利用SSR 標記對谷子DUS 測試品種進行品種鑒定與遺傳多樣性分析是一種有效手段[22]。因而，本研究也為包括新育成品系在內的其他谷子分子指紋圖譜的建立與品種的分子鑒定提供了借鑒。

本研究利用高質量的20 個SSR 標記對DUS測試品種進行指紋鑒定，平均每個標記檢出的等位變異數為9.15 個，20 個位點的平均多態性信息含量（PIC）為0.77；同時，應用上述SSR 標記對來自春谷區與夏谷區的共計52 份谷子區試品種分別進行了分子鑒定，厘清了品系間的遺傳相似性，為谷子品種資源利用與遺傳改良奠定理論基礎。

參考文獻：

［1］ 刁現民. 中國谷子產業與產業技術體系[M]. 北京：中國農業科學技術出版社，2011：21.

DIAO X M. Millet industry and industrial technology system inChina[M]. Beijing：China Agricultural Science and TechnologyPress，2011：21.

［2］ AUSTIN D F. Fox-tail millets（Setaria：Poaceae）-abandonedfood in two hemispheres[J]. Economic Botany，2006，60（2）：143-158.

［3］ BARTON L，NEWSOME S D，CHEN F H，et al. Agriculturalorigins and the isotopic identity of domestication in NorthernChina[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America，2009，106（14）：5523-5528.

［4］ 楊天育，牟平，孫萬倉，等. 中國北部高原地區谷子品種遺傳差異的SSR 分析[J]. 西北植物學報，2010，30（9）：1786-1791.

YANG T Y，MOU P，SUN W C，et al. Genetic variation of fox?tail millet cultivars in north plateau region of China by SSRmarkers[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2010，30（9）：1786-1791.

［5］ 田伯紅. 谷子地方品種和育成品種的遺傳多樣性研究[J]. 植物遺傳資源學報，2010，11（2）：224-228.

TIAN B H. Genetic diversity of Landrace and improved culti?vars in foxtail millet[J]. Journal of Plant Genetic Resources，2010，11（2）：224-228.

［6］ 李志江，刁現民. 谷子分子標記與功能基因組研究進展[J]. 中國農業科技導報，2009，11（4）：16-22.

LI Z J，DIAO X M. Research progress on molecular marker andfunctional genomic of foxtail millet，Setaria italica beauv[J]. Jour?nal of Agricultural Science and Technology，2009，11（4）：16-22.

［7］ JIA G Q，SHI S K，WANG C F，et al. Molecular diversity andpopulation structure of Chinese green foxtail（Setaria viridis（L.） Beauv.）revealed by microsatellite analysis[J]. Journal ofExperimental Botany，2013，64（12）：3645-3656.

［8］ WANG C F，CHEN J F，ZHI H，et al. Population genetics of fox?tail millet and its wild ancestor[J]. BMC Genetics，2010，11（1）：90.

［9］ WANG C F，JIA G Q，ZHI H，et al. Genetic diversity and popu?lation structure of Chinese foxtail millet（Setaria italica（L.）Beauv.）landraces[J]. G3，2012，2（7）：769-777.

［10］ JIA X P，SHI Y S，SONG Y C，et al. Development of ESTSSRin foxtail millet（Setaria italica）[J]. Genetic Resourcesand Crop Evolution，2007，54（2）：233-236.

［11］ 賈小平，譚賢杰，李永祥，等. 用SSR 標記研究谷子品種的遺傳多樣性[J]. 江西農業大學學報，2009，31（4）：633-638.

JIA X P，TAN X J，LI Y X，et al. A study on the genetic diver?sity of foxtail millet cultivars by SSR markers[J]. Acta Agricul?turae Universitatis Jiangxiensis，2009，31（4）：633-638.

［12］ JIA X P，ZHANG Z B，LIU Y H，et al. Development and ge?netic mapping of SSR markers in foxtail millet（Setaria italica（L.） P. Beauv.）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2009，118（4）：821-829.

［13］ 朱建楚. 基于PCR 標記的糜子遺傳多樣性分析[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2005.ZHU J C. Genetic diversity analysis of broomcorn millet basedon PCR markers[D]. Yangling：Northwest A & F University，2005.

［14］ YEH F C，YANG R C，BOYLE T，et al. POPGENE， ver?sion 1.32：the user friendly software for population geneticanalysis[CP]. Molecular Biology and Biotechnology Centre，University of Alberta，Edmonton，AB，Canada，1999.

［15］ LIU K J，MUSE S V. PowerMarker：an integrated analysis en?vironment for genetic marker analysis[J]. Bioinformatics，2005，21（9）：2128-2129.

［16］ ROHLF F J. NTSYS-pc-numerical taxonomy and multivariateanalysis system[CP]. Exeter Software，Setauket，New York. 2000.

［17］ 王姍姍，張寧，王凱璽，等. 中國遼西地區谷子品種遺傳多樣性的SSR 分析[J]. 分子植物育種，2015，13（5）：1091-1097.

WANG S S，ZHANG N，WANG K X，et al. Genetic diversityof foxtail millet cultivars in western Liaoning Province revealedby SSR markers[J]. Molecular Plant Breeding，2015，13（5）：1091-1097.

［18］ 朱學海，張艷紅，宋燕春，等. 基于SSR 標記的谷子遺傳多樣性研究[J]. 植物遺傳資源學報，2010，11（6）：698-702.

ZHU X H，ZHANG Y H，SONG Y C，et al. Genetic diversityanalysis of foxtail millet accessions revealed by SSR markers[J]. Journal of Plant Genetic Resources，2010，11（6）：698-702.

［19］ LE THIERRY D?ENNEQUIN M，PANAUD O，TOUPANCEB，et al. Assessment of genetic relationships between Setariaitalica and its wild relative S. viridis using AFLP markers[J].Theoretical and Applied Genetics，2000，100（7）：1061-1066.

［20］ LI W，ZHI H，WANG Y F，et al. Assessment of genetic rela?tionship of foxtail millet with its wild ancestor and close rela?tives by ISSR markers[J]. Journal of Integrative Agriculture，2012，11（4）：556-566.

［21］ 于淑婷，楊延兵，陳二影，等. 華北夏谷區近30 年來主要谷子育成品種農藝和品質性狀演變分析[J]. 山東農業科學，2017，49（2）：15-19.

YU S T，YANG Y B，CHEN E Y，et al. Evolution of agro?nomic and quality traits of main foxtail millet varieties in NorthChina bred in past thirty years[J]. Shandong Agricultural Sci?ences，2017，49（2）：15-19.

［22］ 董玉琛，曹永生. 糧食作物種質資源的品質特性及其利用[J].中國農業科學，2003，36（1）：111-114.

DONG Y C，CAO Y S. Quality characteristics of germplasmresources of food crops and their utilization[J]. Scientia Agricul?tura Sinica，2003，36（1）：111-114.