基于肉品調料的甜面醬米曲霉菌種制曲條件與酶活力研究

文永平　肖龍泉　周琳　鄧靜　王俊丁　孟凡冰　劉達玉

摘要：近年來，基于甜面醬基料的醬肉調料、烤肉調料、炒肉調料的產業化，對甜面醬的感官品質和發酵菌種提出了更高的要求，生產急需制備糖化酶活力更高的成曲。以從醬油園選育的菌株米曲霉A3-U8為制曲菌種，采用響應面試驗設計方案，研究了制曲時間、制曲溫度、制曲濕度、菌粉接種量等因素對成曲酶活的影響。結果表明，米曲霉A3-U8的最優培養條件為制曲時間47.5 h、制曲溫度32.2 ℃、制曲濕度90.0%、菌粉接種量4.9×106個/g。此條件下曲料糖化酶活為972 U/g干基，中性蛋白酶活為232 U/g干基。該種曲在實踐中應用，顯著縮短了甜面醬生產的水解時間，為開發濃香型高色度甜面醬提供了前期酶解成曲保障。

關鍵詞：肉品調料；甜面醬；醬油；米曲霉；制曲；糖化酶

中圖分類號：TS264.24文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2023）06-0041-06

Abstract： In recent years， the industrialization of sauced meat seasoning， barbecue seasoning and fried meat seasoning based on the sweet soybean paste basic material has put forward higher requirements for the sensory quality and fermentation strains of sweet soybean paste， and it is urgent to prepare finished koji with higher glucoamylase activity in production. With the strain? Aspergillus oryzae A3-U8 selected from soy sauce garden as the koji-making strain， the effects of koji-making time， koji-making temperature， koji-making humidity and inoculation amount of bacterial powder on the enzyme activity of finished koji are studied by response surface test design scheme. The results show that the optimal culture conditions of Aspergillus oryzae A3-U8 are koji-making time of 47.5 h， koji-making temperature of 32.2 ℃， koji-making humidity of 90.0% and the inoculation amount of? bacterial powder of 4.9×106/g. Under such conditions， the glucoamylase activity of koji is 972 U/g dry basis and the neutral protease activity is 232 U/g dry basis. The application of this kind of koji in practice has significantly shortened the hydrolysis time of sweet soybean paste production， and? provided a guarantee? of enzymatic

收稿日期：2022-12-06

基金項目：四川省科技計劃項目（2021YFN0057，2021YFN0008，2022YFS0514）；烹飪科學四川省高等學校重點實驗室資助項目（PRKX2021Z08）

作者簡介：文永平（1982－），男，講師，博士，研究方向：分子生物學。

*通信作者：周琳（1994－），女，助理實驗師，碩士，研究方向：發酵調味品。

hydrolysis of finished koji for the development of strong-flavor and high-chroma sweet soybean paste in the early stage.

Key words： meat seasoning; sweet soybean paste; soy sauce; Aspergillus oryzae; koji making; glucoamylase

在甜面醬的釀造過程中，小麥面粉等物料經過蒸料冷卻和接種培養后，即可得到成曲，俗稱面糕曲[1-2]。目前，甜面醬的工業化制曲所使用的霉菌多為米曲霉As3.042，該菌株是從傳統醬油曲中分離馴化的菌株，能顯著提升曲料的蛋白酶活和成品醬油的氨基酸態氮含量[3]。甜面醬因其原料特性需要較高的糖化酶。因此，選育基于糖化酶活高的菌株是發展的趨勢[4-5]，利用具有糖化酶活力更強的優良菌株，研究制曲工藝對成曲質量的影響規律，優化制曲工藝條件， 對甜面醬生產具有重要的現實意義。特別是近年來對甜面醬的二次開發已經形成新的業態，如基于甜面醬的醬肉調料、烤肉調料、炒肉調料的產業化，對甜面醬的感官品質和發酵菌種提出了更高的要求，生產急需制備糖化酶活力更高的成曲。本試驗以小麥粉、大豆、黑米為原料，選用糖化酶活較高的米曲霉A3-U8，以糖化酶活力、中性蛋白酶活力為評價指標，通過單因素試驗和響應面優化試驗得到最佳制曲條件，并在實踐中對制備的成曲進行應用評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售小麥粉、大豆、黑米；米曲霉A3-U8是由實驗室保存的誘變菌株，從醬油種曲中分離純化和誘變得到，是具有較高酶活且遺傳穩定的優良菌株。Folin試劑（分析純）：成都科龍化學試劑廠；酪氨酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BSC-250恒溫恒濕箱 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；JH-2超凈工作臺 北京科偉永興儀器有限公司；PH2000生物顯微鏡 鳳凰光學控股有限公司；UV-1800PC紫外分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 米曲霉菌粉的制備

麩皮、面粉、水按8∶2∶10的比例混合均勻后置于三角瓶中（三角瓶中料的厚度以2～3 cm為宜），滅菌冷卻后接種米曲霉A3-U8。接種后在（32±2） ℃的環境下恒溫培養3 d，過程中若發現三角瓶內結塊應及時搖瓶。培養結束后將三角瓶中物料置于烘箱中干燥（溫度＜38 ℃），干燥至水分含量≤10%，過120目篩，再利用顯微鏡對菌粉的孢子數進行測定。

1.4 制曲工藝流程

將1 kg小麥粉、100 g大豆粉、50 g黑米粉與345 mL水混合均勻，放入曲盤內在蒸鍋中蒸熟，蒸熟的曲料冷卻至40 ℃后接種米曲霉[6]。因米曲霉菌粉的接種量小，在接種前菌粉需與其質量10～20倍的無菌面粉混合，再接入蒸熟的曲料中，確保米曲霉均勻接入熟料中。

1.5 理化指標的測定方法

糖化酶活力的測定：參考孫淑琴、趙凱等改良的DNS比色法[7-8]。中性蛋白酶活力的測定：參照SB/T 10317-1999中的方法對中性蛋白酶活力進行測定。

1.6 制曲工藝的單因素試驗

1.6.1 制曲時間對酶活的影響

在接種量6×106個/g、溫度32 ℃、濕度85%的條件下，每隔6 h測定一次曲料糖化酶和中性蛋白酶的活力，考察不同制曲時間對曲料酶活的影響。

1.6.2 制曲溫度對酶活的影響

固定菌粉接種量6×106個/g、濕度85%、培養時間42 h，考察不同溫度（26，28，30，32，34，36 ℃）對曲料酶活的影響。

1.6.3 制曲濕度對酶活的影響

固定菌粉接種量6×106個/g、溫度32 ℃、培養時間42 h，考察不同制曲濕度（70%、75%、80%、85%、90%、95%）對曲料酶活的影響。

1.6.4 菌粉接種量對酶活的影響

接種的菌粉為實驗室制作，不同批次菌粉中孢子數有一定差異，因此會對每批次菌粉的孢子數進行計數，再按原料質量計算加入菌粉的質量，大致添加量為原料質量的3‰。為探討菌粉接種量對酶活力的影響，在溫度32 ℃、濕度85%、培養時間42 h的條件下，分別接種3×106，4×106，5×106，6×106，7×106，8×106個/g菌粉。

1.7 響應面優化制曲工藝

甜面醬以小麥粉為主要釀造原料，原料中糖類物質含量更高，因此對糖化酶活的要求更高。在單因素試驗的基礎上，以糖化酶活作為評價指標，利用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken Design對米曲霉A3-U8制曲工藝進行四因素三水平的響應面優化試驗，試驗設計見表1。

2 結果與分析

2.1 制曲條件的單因素試驗結果

2.1.1 制曲時間對曲料酶活的影響

制曲時間對曲料糖化酶和中性蛋白酶活的影響見圖1。

由圖1可知，糖化酶活和中性蛋白酶活隨著時間的不斷延長呈先上升后下降的趨勢。這是因為隨著制曲時間的延長，米曲霉充分生長并產酶，曲料中酶活逐漸上升，但制曲時間過長會出現營養不足、雜菌污染等，導致米曲霉的生長受到抑制，曲料酶活降低[9]。但兩種酶活的變化趨勢并非完全相同，蛋白酶活在制曲時間42 h時最高，為228 U/g干基，糖化酶活在制曲48 h時達到最高，為826 U/g干基。其中，中性蛋白酶活在制曲48 h時有一定下降，但酶活與制曲42 h差異并不顯著，而糖化酶活在42～48 h內顯著上升。甜面醬不同于豆醬、醬油、納豆等以高蛋白原料為主的發酵品，需要較高的蛋白酶活，更需要較高的糖化酶水解糖類。因此，控制曲時間為42～54 h，以48 h為中間值進行響應面優化試驗。

2.1.2 制曲溫度對曲料酶活的影響

制曲溫度對曲料糖化酶和中性蛋白酶活的影響見圖2。

由圖2可知，中性蛋白酶活力受溫度的影響較大，不同溫度下酶活呈現顯著性差異。其中，在28～30 ℃的范圍內，溫度升高有利于米曲霉生長，蛋白酶活逐漸增加；當溫度在30 ℃時，中性蛋白酶活最高，為252 U/g干基，溫度繼續升高會導致曲料的水分蒸發過快，出現燒曲現象，蛋白酶活降低。在醬油釀造中所使用的米曲霉As3.042的最佳制曲溫度也常為30 ℃[10-11]。糖化酶活雖呈現先升高后降低的趨勢，但糖化酶活最高時制曲溫度為32 ℃，此溫度下中性蛋白酶活力較30 ℃時少8.73%，但酶活仍在200 U/g干基以上，滿足甜面醬生產中對曲料蛋白酶活的要求。因此，溫度參數以32 ℃為中心數值，選擇28，30，32 ℃進行響應面優化試驗。

2.1.3 制曲濕度對曲料酶活的影響

制曲濕度對曲料糖化酶和中性蛋白酶活的影響見圖3。

由圖3可知，糖化酶活和中性蛋白酶活受制曲濕度的影響一致，隨著制曲濕度的增加，酶活上升，在制曲濕度達到90%時，糖化酶活達到最大值826 U/g干基，中性蛋白酶活達到最大值231 U/g干基，但再增加濕度，兩種酶活均顯著性下降。因此，選擇制曲相對濕度80%～90%用于響應面試驗。

2.1.4 接種量對曲料酶活的影響

接種量對曲料糖化酶和中性蛋白酶活的影響見圖4。

由圖4可知，米曲霉菌粉接種量的大小對曲料兩種酶活的影響一致。當菌粉接種量在3×106～5×106個/g時，酶活隨著接種量的增加而增加，在接種量為5×106個/g時，糖化酶活和中性蛋白酶活分別達到最大值713 U/g干基和219 U/g干基。若再繼續增加接種量，酶活反而降低。這可能是因為接種量不足時，菌體細胞生長繁殖不足，導致酶活低；隨著接種量的持續增加，酶活增加，但接種量超過5×106個/g時，原料中微生物間的競爭性增加，營養物質不夠形成大量休眠孢子，而引起酶活下降[12]。因此，選擇接種量4×106～6×106個/g用于響應面試驗。

2.2 響應面優化米曲霉制曲工藝

2.2.1 響應面試驗設計及結果分析

在單因素試驗的基礎上，以曲料的糖化酶活為指標，對制曲時間（X1）、制曲溫度（X2）、制曲濕度（X3）、接種量（X4）這4個因素進行優化，以確定米曲霉A3-U8的最佳制曲工藝，試驗結果見表2。

通過對表2中試驗數據進行回歸分析和多項式擬合，得到接種米曲霉A3-U8所得曲料的糖化酶活與制曲時間（X1）、制曲溫度（X2）、制曲濕度（X3）、接種量（X4）的多元回歸方程：糖化酶活Y=926.60－20.33X1－18.00X2+20.92X3－4.42X4－74.50X1X2+10.50X1X3+11.00X1X4+21.25X2X3－0.50X2X4+26.25X3X4－160.80X12－131.17X22－79.30X32－16.92X42。

方差分析結果見表3。

由表3可知，模型的F值為91.80，P值<0.000 1，表明模型極顯著，失擬項的P=0.429 1＞0.05，不顯著。模型的相關系數RAdj2=0.978 4，RPred2=0.948 5，表明模型的擬合程度良好。且各因素對曲料中糖化酶活的影響大小順序為：制曲溫度（X2）>制曲時間（X1）>制曲濕度（X3）>菌粉接種量（X4）。其X1、X2、X1X2、X3X4、X12、X22、X32為極顯著因素（P＜0.01）；X3、X2X3、X42對糖化酶活的影響顯著（P＜0.05），而X4、X1X3、X1X4、X2X4對糖化酶活的影響不顯著（P＞0.05）。

通過軟件繪制4個因素之間的6組交互作用，對兩兩因素交互作用的影響進行分析，以確定最優的制曲工藝。交互作用結果見圖5～圖10。

由圖5～圖10可知，4個因素在所選擇的試驗范圍內均存在響應值，且X1X2、X3X4的交互作用極顯著（P＜0.01）；X2X3的交互作用顯著（P＜0.05），X1X3、X1X4、X2X4的交互作用不顯著（P＞0.05），與方差分析所得結果一致。并通過軟件計算回歸模型，預測出米曲霉A3-U8的最優制曲條件為制曲時間47.50 h、制曲溫度32.22 ℃、制曲濕度90.29%、菌粉接種量4.89×106個/g，且預測出該條件下糖化酶活能達到930 U/g干基。

2.2.2 最優工藝條件驗證及應用評價

考慮操作實際情況對制曲工藝進行調整修正，修正后米曲霉A3-U8的制曲條件為制曲時間47.5 h、制曲溫度32.2 ℃，制曲濕度90.0%、菌粉接種量4.9×106個/g。并對該條件優化后的制曲條件進行驗證，測得此條件下制得曲料糖化酶活為972 U/g干基，中性蛋白酶活為232 U/g干基，糖化酶活與軟件預測值相對誤差僅為4.32%。因此，采用響應面法優化得到的制曲工藝條件的回歸模型與實際相符合。并且以本試驗制備的成曲為主要菌種，添加黑曲霉、紅曲酶分別所制曲料為補充，構建組合發酵，菌曲比為100∶10∶2，采用先保溫后發酵工藝，在50 ℃的條件下水解9 d，得到的醬醪還原糖量為25.62%，氨基酸態氮含量為0.36%，顯著縮短了甜面醬的水解時間，同時對甜面醬成品的感官品質和理化指標具有明顯改善作用[13]。

3 結論

本文選用從傳統優質的醬油種曲中分離誘變得到的米曲霉A3-U8，以糖化酶活和蛋白酶活為指標進行單因素試驗，發現糖化酶活與蛋白酶活的變化趨勢并不相同?？紤]甜面醬發酵對糖化酶有較高要求，因此以糖化酶為指標進行響應面優化試驗，結果表明4個因素對糖化酶活影響的大小順序為制曲溫度＞制曲時間＞制曲濕度＞菌粉接種量。同時，確定米曲霉的最優甜面醬制曲條件為制曲時間47.5 h、制曲溫度32.2 ℃、制曲濕度90.0%、菌粉接種量4.9×106個/g。此條件下曲料糖化酶活為972 U/g干基，中性蛋白酶活為232 U/g干基。該種曲在實踐中應用，為開發濃香型高色度甜面醬提供了前期酶解菌種保障，對賦能各類高品質肉類調料的開發具有重要作用。

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