響應面法優化提取瓜蔞皮中總三萜的研究

曹 婧 胡煜璇 范杰平※

（1.江西中醫藥高等?？茖W校藥學系，江西 撫州 344000；2.南昌大學資源環境與化工學院， 江西 南昌 330031）

瓜蔞（Trichosanthis frucutus）為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowiiMaxim）的干燥成熟果實，又被稱為全瓜蔞。2015 版《中華人民共和國藥典》［1］記載瓜蔞的功效為潤肺化痰、潤腸通便，用于燥咳痰黏、腸燥便秘?，F代藥理學研究［2，3］表明，瓜蔞對腫瘤細胞具有抑制作用。瓜蔞中含有大量的萜類化合物，主要屬于三萜類化合物。目前國內外大部分研究都是從瓜蔞子中提取，而對瓜蔞皮中的三萜皂苷研究不多［4-8］。本實驗以瓜蔞皮中總三萜為對象，采用乙醇冷凝回流提取的方式，通過響應面分析法對工藝進行優化，對擬合數學模型進行描述，為總三萜的進一步開發和利用提供科學依據。

1 實驗器材

1.1 主要儀器 電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；FZ102粉碎機（浙江省永康市松青五金廠）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；磁力攪拌器（鄭州杜甫儀器廠）。

1.2 原材料 瓜蔞皮（江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司）。

1.3 主要試劑 齊墩果酸標準品（南京清韻生物科技有限公司）；香草醛、冰乙酸、高氯酸、甲醇、乙醇等試劑為國產分析純，實驗室用水為一次蒸餾水。

2 實驗方法

2.1 瓜蔞粉末的準備 采用高速多功能粉碎機將瓜蔞皮干燥飲片粉碎，并過40目篩，篩成細粉，裝入密封塑料袋，貼上標簽，備用。

2.2 標準曲線方程 以齊墩果酸標準品為對照，精密稱取7.5 mg 齊墩果酸對照品，用甲醇溶解，定容在25 mL的容量瓶中，配制成0.3 mg/mL 的母液。分別精密量取齊墩果酸母液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 至10 mL容量瓶中，水浴鍋中揮干甲醇；各自加入1.6 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液與3.2 mL 的高氯酸，60 ℃恒溫水浴鍋中加熱20 min；取出冷卻后，用冰醋酸稀釋至刻度，再用紫外分光光度法于548 nm 波長處測量吸光度，得到齊墩果酸標準曲線方程。

2.3 總三萜的提取及測定方法 精密稱取規定量的瓜蔞粉，加入規定體積和濃度的乙醇，在規定溫度的水浴鍋中冷凝回流規定時間；抽濾，濾液冷卻后倒入100 mL 容量瓶，并加入對應濃度的乙醇溶液定容至刻度。分別從各組單因素實驗得到的樣品溶液中精密移取0.4 mL 于10 mL 容量瓶中，水浴鍋中揮干溶劑；再各自加入1.6 mL 的5%香草醛-冰醋酸溶液與3.2 mL 的高氯酸，60 ℃恒溫水浴鍋中加熱20 min；取出冷卻后，用冰醋酸稀釋至刻度，用紫外分光光度法在548 nm 波長處測量吸光度。再用線性回歸方程計算相應的提取率。

2.4 總三萜提取率的計算 總三萜提取率=產品中總三萜的含量（g）/瓜蔞粉試樣的重量（g）×100%。

3 結果與分析

3.1 標準曲線 根據不同齊墩果酸濃度對應的吸光度，計算得到的線性回歸方程為A=58.505C-0.1986，R2=0.9966，線性范圍為0.06～0.21 mg。

3.2 單因素試驗結果

3.2.1 回流時間對提取率的影響 按照實驗方法2.3 項，精密稱取1 g 瓜蔞粉置于100 mL 圓底燒瓶，加入40 mL的50%乙醇溶液，于70 ℃水浴鍋中冷凝回流，改變提取時間。實驗結果見圖1。

圖1 回流時間對提取率的影響

從圖上看，最佳回流提取的時間為70 min。因曲線過于平緩，各回流時間下的提取率相差不大，因此直接選取70 min 進行之后的實驗，不參與響應面的單因素分析。

3.2.2 乙醇濃度對提取率的影響 按照實驗方法2.3 項，精密稱取1 g 瓜蔞粉，置于100 mL 圓底燒瓶，分別加入60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液40 mL，在70 ℃水浴鍋中冷凝回流提取70 min，實驗結果見圖2。

圖2 乙醇濃度對提取率的影響

隨著乙醇濃度的升高，提取率先變化不明顯，然后在80%～90%范圍內呈明顯上升趨勢，當乙醇濃度達到90%時提取率最高，三萜類物質的溶解度達到最大；之后提取率下降。推測是由于90%乙醇溶液的極性與三萜皂苷的極性相似，提取率明顯增大。

3.2.3 液固比對提取率的影響 按照實驗方法2.3 項，精密稱取1 g瓜蔞粉，置于100 mL圓底燒瓶，90%的乙醇改變液固比，70 ℃水浴鍋冷凝回流提取70 min。實驗結果見圖3。

圖3 液固比對提取率的影響

從圖上看，隨著液固比的增加，總三萜提取率呈現由低到高并趨于穩定的趨勢。推測是溶劑的增加使物料與溶劑的接觸面增大，有利于擴散速度的提高。當液固比達到70 mL/g 時提取率最大，但與60 mL/g 的提取率相差不大，考慮到經濟因素，選擇60 mL/g 作為最佳液固比。

3.2.4 提取溫度對提取率的影響 按照實驗方法2.3項，精密稱取1 g 瓜蔞粉，加入60 mL 的90%乙醇溶液，在不同溫度下冷凝回流提取70 min。實驗結果見圖4。

圖4 提取溫度對提取率的影響

隨著溫度的升高，提取率增加，并呈緩緩上升趨勢；當溫度達到80 ℃時提取率最大，超過80 ℃后略有下降。這是由于隨著溫度的升高，三萜皂苷類物質的擴散速率加快，溶解度也增大，提取率提高，但溫度過高會造成水浴鍋中揮干甲醇物質易被破壞，而使提取率下降，并且也會使后續操作更為困難。因此提取時溫度選擇80 ℃為宜。

3.3 響應面法優化提取總三萜 選取影響提取過程較大的3 個因素：乙醇濃度、液固比和提取溫度為自變量，精密稱取1 g 瓜蔞粉，置于100 mL 圓底燒瓶，選取乙醇濃度（A）、液固比（B）和提取溫度（C）3 個因素在回流時間為70 min 的條件下進行Box-Behnken 響應面分析設計［9-11］，以提取率為指標優化提取條件。實驗因素及其水平設計見表1。實驗按隨機化的原則進行，以減少隨機誤差。實驗安排及結果見表2。

表1 自變量及其水平

表2 實驗安排及結果

3.3.1 模型評價 以實驗所得的總三萜提取率為響應值，借助Design-Expert Software，對三元二次方程進行擬合，便能夠得到一個多項式回歸方程，即：Y=2.25-0.14A-0.027B-0.028C+0.033AB-0.11AC-0.038BC-0.19A2-0.051B2-0.019C2。F值越大，P值越小，意味著該項越顯著。

從表3 可以看出，回歸模型的P值為0.0003＜0.001，具有極其顯著性差異，表明本實驗使用的模型具有統計學意義；失擬項的P值為0.0501，大于0.05，表明差異不顯著，擬合程度較好，殘差由隨機誤差引起，對實驗結果基本無影響，這表明響應面法優化瓜蔞皮中總三萜類化合物的提取工藝是可行的。比較回歸方程中的一次項系數，可以看出，對瓜蔞皮中總三萜提取率的影響因素大小順序為：A（乙醇濃度）＞C（提取溫度）＞B（液固比）。

表3 回歸系數的顯著性分析

通過對模型的擬合分析，得到最佳的總三萜提取條件，即乙醇濃度82.62%，液固比51.29 mL/g，溫度90 ℃。為了方便實際操作，將提取條件調整為乙醇濃度83%，液固比51 mL/g，提取溫度90 ℃。

3.3.2 響應面分析 3-D 曲面是回歸方程的直觀表達形式?？疾鞌M合響應曲面的形狀，分析乙醇濃度、提取溫度和液固比對總三萜提取率的影響（結果見圖5）。由實驗可知對提取率影響最大的為乙醇濃度，圖中等高線最為密集，傾斜度也最高，說明乙醇濃度與回流溫度的交互作用最為顯著，對提取率的影響程度更大。

圖5 響應面圖

3.3.3 最優條件及驗證 以響應面法優化后得到的最優提取條件進行工藝驗證實驗，3 次實驗測得的提取率分別 為2.336%、 2.310%、 2.327%， 平 均 值 為2.324%。Design-Expert 預測的提取率為2.320%，測定值與預測值的偏差為0.187%，數值很小，說明該模型的預測性很好。

4 結論

本研究是在單因素實驗的基礎上，采用響應面法優化乙醇提取瓜蔞皮中總三萜的工藝參數，再建立回歸方程模型；從顯著性上看差異具有統計學意義，預測性也很好，這說明響應面法優化瓜蔞皮中總三萜類化合物的提取工藝是可行、可靠的。本次實驗最終得到的最佳冷凝回流提取條件為乙醇濃度83%，液固比51 mL/g，提取時間70 min，提取溫度90 ℃；該條件下得到的總三萜最佳提取率為2.324%。三萜類化合物具有較高的醫用和食用價值，該實驗為瓜蔞皮中總三萜的進一步研究提供了一定的參考依據。