miR-146b-5p調控CD82介導食管鱗狀細胞癌惡性表型

譚依依, 黃叢改,2, 鄭振淵, 彭天元, 王 薇, 盧曉梅

(1新疆醫科大學第一附屬醫院, 烏魯木齊 830054; 2西南醫科大學附屬醫院病理科, 四川 瀘州 646000;3汕頭大學醫學院, 廣東 汕頭 515000)

食管癌(Esophageal cancer,EC)位居全球常見腫瘤第6位[1]。我國是食管癌的高發區,約占全球新發病例的50%[2]。食管癌在組織病理學上可分為食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma,EAC)和食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。我國EC新發病例以ESCC為主,約占 90%[3],但ESCC轉移的分子機制尚不清楚。微小核糖核酸(miRNA)是一類非編碼短鏈RNA,通過與靶向mRNA的3′非翻譯區(3′UTR)互補序列結合[4],促進mRNA降解或抑制翻譯,參與多種生物學功能的調節。近年來,有關miRNA在腫瘤轉移中的具體作用越發得到重視。在ESCC中,miRNA在調節腫瘤轉移和惡性程度方面形成了復雜的調控網絡[5]。本課題組前期基于miRNA表達譜分析發現,miR-146b-5p在ESCC組織中的表達顯著上調[6],相似的研究結果在其他腫瘤中也得到了驗證[7-9],但miR-146b-5p在ESCC中的具體調控機制尚需闡明。CD82/KAI1是四次跨膜蛋白超家族成員之一,1995年在前列腺癌中被鑒定為腫瘤轉移抑制因子[10],該蛋白在正常組織中呈高表達,而在腫瘤組織中表達顯著性下調。本課題組前期研究結果顯示,CD82在ESCC組織中呈現低表達[11]。其他研究也證實CD82在多種實體瘤中可抑制腫瘤的進展和轉移[12-16]。本課題組結合生物信息學miRNA調控靶標預測結果,推測miR-146b-5p可能通過靶向調控CD82介導ESCC的惡性表型。本研究旨在通過生物信息學分析、免疫印跡法、報告基因實驗等明確CD82是否是miR-146b-5p的下游靶基因,探究miR-146b-5p對CD82的調控作用,為ESCC轉移的治療尋找新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象在前期研究選取的6對ESCC患者miRNA表達譜分析的基礎上,本研究擴大樣本量,選取2020年10月-2021年12月在四川省西南醫科大學附屬醫院行食管癌根治術治療的38名ESCC患者的癌組織和癌旁正常組織(NAT)樣本。NAT距腫瘤邊緣5 cm以上,病理證實未見腫瘤細胞浸潤。納入標準:(1)組織病理學診斷為ESCC;(2)術前未接受任何放療或化療;(3)臨床病理資料完整。排除標準:(1)其他惡性腫瘤患者;(2)有輸血和免疫治療史者。本研究已通過西南醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會審批(審批號:KY2022274),所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑 人ESCC細胞系KYSE30、KYSE150、KYSE510和人胚腎細胞293T細胞由汕頭大學醫學院腫瘤研究中心贈送。CD82抗體(武漢三鷹,貨號:66803-1-Ig),GAPDH抗體(美國ImmunoWay生物技術,貨號:YM3029),jetPRIME轉染試劑(法國polyplus公司,貨號:1010000),miR-146b-5p原位雜交試劑盒(博士德生物,貨號:MK11220),DAB染色試劑盒(中山金橋生物,貨號:ZLI-9018),psiCHECK(TM)-2-hCD82_3′UTR野生型(wt)和psiCHECK(TM)-2-hCD82_3′UTR突變型(mut)質粒均購自云舟生物科技(廣州)股份有限公司;雙熒光素酶報告基因試劑盒(諾唯贊生物,貨號:DL101),EdU-594細胞增殖檢測試劑盒(碧云天公司,貨號:C0078),miR-146b-5p抑制劑(miR-146b-5p inhibitor)、miR-146b-5p模擬物(miR-146b-5p mimic)均購自上海吉瑪制藥技術有限公司,LV-hsa-miR-146b-5p sponge和LV-hsa-miR-146b購自漢恒生物科技(上海)有限公司。

1.2.2 原位雜交 miR-146b-5p原位雜交試劑盒和配套試劑均嚴格按照說明書操作。所有載玻片在42℃培養箱中孵育過夜,DAB染色后在顯微鏡下觀察。has-miR-146b-5p靶基因序列:5′-UGAGAACU-GAAUUCCAUAGGCUG-3′。has-miR-146b-5p探針序列:5′-CAGCCTATGGAATTCAGTTCTCA-3′。

1.2.3 細胞轉染 取對數生長期細胞接種于12孔板中培養過夜,細胞融合度為50%時進行轉染。分別取100 μL jetPRIME buffer,加入終濃度10 nmol/L的陰性對照(Negativecontrol,NC)、inhibitor或mimic,再加入3 μL jetPRIME reagent,孵育10 min后滴加于細胞培養液中,24 h后更換新鮮培養液。轉染48 h進行后續檢測。按此方法分為NC組(陰性對照)、inhibitor組(miR-146b-5p抑制劑處理)、mimic組(miR-146b-5p模擬物處理)。慢病毒穩轉細胞系構建:細胞融合度10%左右時,棄去原有培養基,加入1/2體積新鮮培養基,滴加病毒液進行感染,4 h后補足至完全培養體積。24 h后更換新鮮培養基,48 h后熒光顯微鏡觀察細胞狀態,加入嘌呤霉素進行細胞篩選,篩選終濃度為2 μg/mL,持續7 d,維持終濃度為1 μg/mL。按此方法分為NC組(陰性對照)、KD組(敲低組,即感染LV-hsa-miR-146b-5p sponge)、OE組(過表達組,即感染LV-hsa-miR-146b)。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因實驗 ENCORI數據庫預測miR-146b-5p與CD82結合位點(https://rnasysu.com/encori/)[17],由云舟生物構建攜帶雙熒光素酶報告基因啟動子的野生型CD82′(wt)質粒psiCHECK(TM)-2-hCD82_3′UTR(wt)和該結合位點突變型CD82(mut)質粒psiCHECK(TM)-2-hCD82_3′UTR (mut),在293T細胞、KYSE150、KYSE510細胞中與miR-146b-5p mimic共轉染。48 h后使用報告基因檢測試劑盒檢測細胞熒光強度。

1.2.5 免疫印跡法(Western-blot) 用10%SDS-PAGE凝膠電泳轉膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1～2 h,加入一抗(1∶5 000稀釋),4℃孵育過夜。加入二抗(1∶10 000稀釋),室溫孵育2 h。1×TBST洗膜3次,每次10 min,化學發光顯影。

1.2.6 條件培養基(Conditional medium, CM)制備 提前一天棄去培養皿中原有培養基,加入無血清1640培養基,培養細胞24 h后吸出培養基,室溫,1 000 r/min,離心10 min,使用0.45 μM濾膜的無菌過濾器過濾上清,獲得條件培養基,-80℃保存。使用時,冰上解凍,以1∶1的比例混合條件培養基和無血清1640培養基,培養ESCC細胞24 h后進行劃痕實驗。用NC-CM表示使用NC來源CM處理,KD-CM表示使用KD組來源CM處理,OE-CM表示使用OE組來源CM處理。

1.2.7 細胞增殖與劃痕實驗 提前一天將細胞按每組6個復孔,每孔以1×104個接種于96孔板。用細胞培養基配制2×EdU工作液,與培養基等體積加入孔板,使EdU終濃度為10 μmol/L,37℃培養箱孵育2 h。標記完成后,4%多聚甲醛室溫固定15 min,含0.3% Triton X-100的PBS室溫孵育10～15 min。加入Click反應液,室溫避光孵育30 min。按1∶1 000比例用PBS稀釋Hoechst 33342 (×1 000),室溫避光孵育30 min,活細胞工作站檢測EdU陽性細胞比例并拍照。在12孔板中接種細胞,細胞融合度80%左右時更換無血清培養基,饑餓處理24 h,每組3個復孔,每個復孔平行劃3條劃痕,更換2%FBS的1640培養基繼續培養。0 h、12 h和24 h拍照記錄。劃痕愈合比例=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.2.8 短發夾RNA(shRNA)設計構建與包裝 使用默克(Merck)公司預設計shRNA工具(https://www.sigmaaldrich.cn)檢索CD82的shRNA序列,序列均位于CD82 3′UTR區,序列及引物見表1。載體使用pLKO.1質粒,所構建質粒經測序比對無誤。轉染后細胞分組為pLKO.1組(即空載組)、shCD82-1組(使用shCD82-1敲低CD82)、shCD82-2組(使用shCD82-2敲低CD82)。在此基礎上,用miR-146b-5p抑制劑或模擬物處理細胞,分為pLKO.1+inhibitor組、pLKO.1+mimic組、shCD82-2+inhibitor組、shCD82-2+mimic組。

表1 shRNA-CD82引物

2 結果

2.1 miR-146b-5p在ESCC組織和NAT中表達水平比較原位雜交實驗結果顯示,miR-146b-5p在ESCC組織中的陽性表達率為86.8%(33/38),在NAT中的陽性表達率為28.9%(11/38)。與NAT組織病理評分(1.32±1.99)比較,miR-146b-5p在ESCC組織中的病理評分(3.16±1.81)較高,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1。

注:與NAT比較, ****P<0.000 1。

2.2 細胞功能實驗結果比較EdU細胞增殖實驗結果顯示,與NC組EdU陽性細胞比例(55.00±4.04)比較,inhibitor組EdU陽性細胞比例(33.53±2.84)顯著下降,mimic組EdU陽性細胞比例(63.80±1.82)顯著上升(P均<0.05)。經慢病毒處理后,與NC組EdU陽性細胞比例(70.75±4.07)比較,KD組EdU陽性細胞比例(54.75±10.10)顯著降低(P<0.05),其余組比較差異無統計學意義(P>0.05)。細胞劃痕實驗結果顯示,在經慢病毒處理后的KYSE30細胞,與NC組劃痕愈合比例(54.86±9.64)比較,KD組劃痕愈合比例(36.91±7.40)顯著下降,OE組劃痕愈合比例(92.53±6.18)顯著上升(P<0.05);將KYSE150細胞慢病毒處理后,與NC組劃痕愈合比例(49.65±7.89)比較,KD組劃痕愈合比例(38.88±6.82)顯著下降(P<0.05),OE組劃痕愈合比例(50.71±7.64)無統計學差異(P>0.05),見圖2A～2D。

注: A-B, EdU細胞增殖實驗結果圖; C-D, 劃痕實驗結果圖。 與NC組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。

2.3 miR-146b-5p與CD82之間的靶向調控作用比較通過ENCORI數據庫預測分析尋找miR-146b-5p下游靶基因。在預測的分子中發現腫瘤轉移抑制因子CD82。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示,與mut+mimic組比較,wt+mimic組相對熒光強度顯著下調(P<0.05),見圖3A。Western-blot實驗結果顯示,與NC組比較,KD組CD82在蛋白水平顯著性上調(P<0.05),見圖3B。構建的shRNA可抑制ESCC細胞中CD82的表達水平,見圖4A。在此基礎上,利用inhibitor上調miR-146b-5p的表達水平或mimic下調miR-146b-5p的表達水平。EdU實驗結果顯示,shCD82-2+inhibitor組和shCD82-2+mimic組EdU陽性細胞比例比較,差異無統計學意義(P>0.05),見圖4B。

注： A, shRNA敲低CD82 Western-blot結果圖; B, 抑制CD82時調節miR-146b-5p, EdU實驗結果圖。 與pLKO.1+inhibitor組比較, **P<0.01。

2.4 條件培養基對ESCC細胞惡性表型的影響加入KD組條件培養基后,與NC-CM組細胞劃痕愈合比例(51.04±11.18)比較,KD-CM組細胞劃痕愈合比例(40.57±5.26)顯著下降(P<0.05),其他組無統計學差異(P>0.05),見圖5。

注: 與NC-CM組比較, *P<0.05。

3 討論

基于我國17個腫瘤登記地區的數據顯示,近年來ESCC患者的5年生存率有所上升,已達30.3%[18],但ESCC仍對我國國民健康造成沉重負擔,預后仍有較大的改善空間。目前,手術治療是ESCC的主要治療方式,經手術治療后的患者短期生存率有所上升,但術后3年復發或轉移率高達40%～60%[19],導致長期預后仍然較差。因此,探明ESCC進展轉移的分子機制,對我國食管癌的診治尤為重要。

本研究通過核酸原位雜交法檢測了miR-146b-5p在ESCC組織中為高表達,通過細胞功能實驗證明miR-146b-5p在ESCC細胞中發揮促進增殖與遷移的作用?？谇击[狀細胞癌中研究顯示,miR-146b-5p在腫瘤成纖維細胞來源外泌體中呈高表達,口腔鱗狀細胞癌細胞可通過內化攝取外泌體中的miR-146b-5p,從而增強增殖、遷移和侵襲能力[20],這與本研究結論一致。為明確miR-146b-5p作用的分子機制,通過ENCORI數據庫預測CD82可能是miR-146b-5p下游靶基因之一,通過雙熒光素酶報告基因實驗、western-blot實驗結果證明CD82確實是miR-146b-5p的一個直接作用的下游靶基因。CD82作為公認的腫瘤抑制因子,在正常組織中高表達,而在癌組織中的表達則是下調[21]。早期研究認為,CD82的抑癌作用表現在抑制腫瘤轉移[22-23]。而近年來部分研究發現,CD82對腫瘤細胞的增殖也有一定的抑制作用[24]。為觀察CD82在ESCC細胞增殖中的作用,本研究構建了能夠抑制CD82表達的shRNA質粒。通過轉染,本研究發現抑制CD82并未能夠顯著性抑制ESCC細胞的增殖。說明CD82在ESCC細胞增殖中的作用是極其有限的。同時,本研究結果也提示miR-146b-5p主要通過靶向調控CD82在ESCC細胞遷移中發揮重要作用。近期研究發現,CD82可參與外泌體的分泌[25-27],且外泌的CD82可重塑腫瘤微環境,從而影響遠處腫瘤細胞的侵襲轉移能力。根據前期研究報道[25-27],可推測ESCC組織中CD82表達下調是由于CD82被腫瘤細胞外泌了,從而導致ESCC組織中CD82為低表達[11]。由此,為了模擬外泌的miR-146b-5p,本研究制備了條件培養基進行細胞培養并進行細胞劃痕實驗。結果顯示,與NC-CM組細胞劃痕愈合比例比較,KD-CM組細胞劃痕愈合比例顯著下降。提示miR-146b-5p可通過影響分泌,影響ESCC細胞的遷移。

綜上所述,miR-146b-5p主要通過靶向調控CD82介導ESCC細胞的遷移。miR-146b-5p或可作為ESCC轉移的潛在生物標志物。miR-146b-5p與CD82之間的靶向調控有望為ESCC治療提供新靶點。本研究的不足之處在于缺少動物實驗,有待后續研究。