CPSF6在晚期非小細胞肺癌中的表達及與預后的關系

謝明珠 朱洪斌 朱楠 鄭炎

摘要：目的? 探討剪切及多聚腺苷酸化特異因子6（CPSF6）在晚期非小細胞肺癌中的表達情況及臨床價值。方法? 利用TIMER2.0分析CPSF6在各腫瘤組織及癌旁組織中的表達差異，TCGA數據庫的可視化平臺GEPIA評估CPSF6在泛癌癥背景下對總生存期的影響，使用GEPIA2工具比較肺癌不同病理分期（Ⅰ～Ⅳ期）中的CPSF6表達情況，在線檢索TCGA數據庫中肺腺癌和肺鱗癌的數據集，并進行生存和預后分析。收集2018年1月-2020年3月我院收治的74例晚期非小細胞肺癌患者腫瘤組織以及20例正常肺組織進行CPSF6免疫組化檢測，Kaplan-Meier生存分析評估CPSF6表達與晚期非小細胞肺癌患者無進展生存期和總生存期的關系，單因素和多因素分析評估CPSF6對肺癌患者預后的意義。結果? TIMER 2.0、TCGA數據庫分析表明非小細胞肺癌患者腫瘤組織中CPSF6 mRNA水平高于癌旁組織（P＜0.05），CPSF6與多種癌癥（包括肺腺癌）患者的預后不良有關。CPSF6在晚期非小細胞肺癌組織表達高于正常肺組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。CPSF6表達增高與腫瘤大小、淋巴結轉移情況及臨床分期相關。Kaplan-Meier生存曲線顯示，晚期非小細胞肺癌患者CPSF6表達增高，無進展生存期和總生存期降低。單因素及多因素分析顯示，CPSF6的表達水平、淋巴結轉移和臨床分期均可作為晚期非小細胞肺癌患者的獨立預后因子（P＜0.05）。結論? CPSF6在晚期非小細胞肺癌組織中表達增高，可能在其預后中發揮重要作用。

關鍵詞：剪切及多聚腺苷酸化特異因子6；非小細胞肺癌；免疫組化

中圖分類號：R734.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.017

文章編號：1006-1959（2024）04-0095-07

Expression of CPSF6 in Advanced Non-small Cell Lung Cancer and its Relationship with Prognosis

XIE Ming-zhu1，ZHU Hong-bin1，ZHU Nan2，ZHENG Yan2

（Department of Respiratory Medicine1，Department of Pathology2，Chaohu Hospital of Anhui Medical University，

Hefei 238000，Anhui，China）

Abstract：Objective? To investigate the expression and clinical value of cleavage and polyadenylation specific factor 6 （CPSF6） in advanced non-small cell lung cancer.Methods? TIMER2.0 was used to analyze the expression differences of CPSF6 in tumor tissues and adjacent tissues. The visualization platform GEPIA of TCGA database was used to evaluate the effect of CPSF6 on overall survival in the context of pan-cancer. The GEPIA2 tool was used to compare the expression of CPSF6 in different pathological stages （stages Ⅰ-Ⅳ） of lung cancer. The data sets of lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma in TCGA database were retrieved online， and survival and prognosis analysis were performed. The tumor tissues of 74 patients with advanced non-small cell lung cancer admitted to our hospital from January 2018 to March 2020 and 20 lung tissues were collected for CPSF6 immunohistochemical detection. Kaplan-Meier survival analysis was used to evaluate the relationship between CPSF6 expression and progression-free survival and overall survival in patients with advanced non-small cell lung cancer. Univariate and multivariate analysis was used to evaluate the prognostic significance of CPSF6 in patients with lung cancer.Results? TIMER 2.0 and TCGA database analysis showed that the level of CPSF6 mRNA in tumor tissues of patients with non-small cell lung cancer was higher than that in adjacent tissues （P<0.05）. CPSF6 was associated with poor prognosis in patients with various cancers， including lung adenocarcinoma. The expression of CPSF6 in advanced non-small cell lung cancer was higher than that in lung tissue， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The increased expression of CPSF6 was correlated with tumor size， lymph node metastasis and clinical stage. Kaplan-Meier survival curve showed that CPSF6 expression was increased in patients with advanced non-small cell lung cancer， and progression-free survival and overall survival were decreased. Univariate and multivariate analysis showed that the expression level of CPSF6 protein， lymph node metastasis and clinical stage could be used as independent prognostic factors for patients with advanced non-small cell lung cancer （P<0.05）.Conclusion? CPSF6 is highly expressed in advanced non-small cell lung cancer tissues and may play an important role in its prognosis.

Key words：Cleavage and polyadenylation specific factor 6;Non-small cell lung cancer;Immunohistochemistry

肺癌（lung cancer）是癌癥相關死亡的主要原因之一，全球每年報告180萬病例和160萬肺癌患者相關死亡病例[1]。肺癌的發病率和死亡率均比較高，其主要包括兩種類型，第一種為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），第二種為小細胞肺癌（small cell carcinoma of the lung，SCLC）。前者占比高達85%，包括肺腺癌、肺鱗癌[2，3]等。目前，隨著聯合治療（包括手術切除和全身化療）以及靶向藥物、免疫藥物等的應用，NSCLC的治療已經得到了改善[4，5]。然而，NSCLC患者的長期生存率仍較低。因此，有必要鑒定與NSCLC患者組織病理學特征和預后相關的新型腫瘤相關標志物，從而為患者的治療和預后研究提供理論依據和思路。本研究前期通過TCGA數據庫檢索發現肺癌患者組織中剪切及多聚腺苷酸化特異因子6（cleavage and polyadenylation specific factor 6，CPSF6）mRNA表達水平與患者臨床分期及生存時間明顯相關，是參與腫瘤發生和進展的一種關鍵蛋白。相關文獻已經證實CPSF6可以作為乳腺癌[6，7]、肝細胞癌[8-10]、胃癌[11]及食管鱗癌[12]等多種癌癥的預后相關基因，但是CPSF6在NSCLC患者中發揮作用的臨床價值尚未闡述清楚。因此，本研究擬探討CPSF6與晚期NSCLC的臨床病理參數和預后之間的關聯。

1資料與方法

1.1生物信息學分析? 利用TIMER2.0（http：//timer.comp-genomics.org/）分析CPSF6在各腫瘤組織及癌旁組織中的表達差異；采用腫瘤基因組計劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫的可視化平臺GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）評估CPSF6在泛癌癥背景下對總生存期的影響；隨后進一步使用GEPIA2工具比較肺癌不同病理分期（Ⅰ～Ⅳ期）中的CPSF6表達情況；在線檢索TCGA數據庫中肺腺癌和肺鱗癌的數據集，并進行生存和預后分析。

1.2一般資料? 收集安徽醫科大學附屬巢湖醫院2018年1月-2020年3月收治并經病理診斷確診的74例晚期NSCLC患者的腫瘤組織標本，其中鱗癌患者43例，腺癌患者31例；男56例，女18例；年齡34～83歲，平均年齡（66.30±9.20）歲；高分化25例，中、低分化49例；Ⅲ期患者28例，Ⅳ期患者46例；無淋巴結受累的患者33例，轉移至淋巴結的患者41例。另選取同期手術切除的20例良性肺部病變患者的正常肺組織手術標本，其中男12例，女8例，年齡32～74歲，平均年齡（51.20±11.70）歲。肺癌分期標準參照2017年美國癌癥聯合會和國際抗癌聯盟（UICC）制定的第八版TNM分期標準。本研究已經獲得安徽醫科大學附屬巢湖醫院倫理委員會的批準（編號：KYXM-202212-016）。所有患者均對研究知情同意。

1.3納入和排除標準? 納入標準：①初次診斷的患者，入院前未經過放療、化療及手術治療等，經臨床和病理診斷確診為NSCLC；②TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期；③肺癌組織相關標本保存完整；④臨床資料保存完整，病理分型、分期及隨訪信息完整。排除標準：①合并有其他腫瘤的患者；②繼發性腫瘤；③隨訪失訪或臨床資料不全者。

1.4 CPSF6蛋白的檢測

1.4.1操作步驟? 采用免疫組織化學染色檢測CPSF6蛋白在晚期NSCLC樣本中的表達：經過常規脫蠟水化后的石蠟切片，先由pH6.0的檸檬酸鈉抗原修復液進行抗原修復，然后使用PBS溶液沖洗，去除多余水分后，繼而添加100 μl內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10 min；PBS溶液沖洗后，滴加100 μl抗兔CPSF6單克隆抗體（按1∶100稀釋），室溫下孵育60 min；PBS溶液沖洗，加100 μl酶標山羊抗兔IgG聚合物，室溫下孵育30 min；經過沖洗，除去多余的PBS溶液后，添加100～200 μl新鮮配比的DAB顯色液，孵育3～5 min，光鏡觀察染色結果；流動水沖洗，復染，脫水封片。

1.4.2免疫組化結果判讀? 由我院病理科經驗豐富的兩位病理診斷醫師進行雙盲閱片。CPSF6表達是基于染色強度和染色陽性的肺癌組織細胞數量兩者進行評價。CPSF6染色陽性的肺癌組織細胞數量可分為0分：0～5%肺癌細胞；1分：6%～25%肺癌細胞；2分：26%～50%肺癌細胞；3分：51%～75%肺癌細胞；4分：76%～100%肺癌細胞；肺癌細胞染色強度可以分為0分：無染色；1分：淡黃色；2分：黃色至淺棕色；3分：棕色至棕褐色。二者的分值相加，總的分數小于6分即表示CPSF6低表達；大于6分即表示CPSF6高表達。

1.5觀察指標? 隨診方式采用門診隨診、住院復查及電話隨診等，主要觀察指標包括無進展生存期（progression-free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）。PFS指自確診開始至發現疾病進展的時間（依據影像學表現）；OS為自確診開始至患者死亡的時間（失訪者為最后隨訪時間；實驗結束時存活患者，為隨訪結束日）。以月為單位，隨訪至2023年3月1日。另外比較所有研究對象的性別、年齡、腫瘤大小、臨床分期、病理類型、分化程度、有無淋巴結轉移、PFS及OS等，分析其CPSF6表達水平。

1.6統計學方法? ?研究數據采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以[n（%）]表示，采用？字2檢驗。選擇Kaplan-Meier法進行生存分析，并行Log-rank檢驗；利用Cox比例風險回歸模型進行多因素分析。P＜0.05表明差異有統計學意義。

2結果

2.1 NSCLC中CPSF6表達的公共數據庫分析? 對TIMER2.0數據庫中泛癌癥數據的分析表明，NSCLC患者腫瘤組織中CPSF6表達水平高于癌旁組織（P＜0.05），見圖1A；CPSF6表達與多種癌癥（包括肺腺癌）患者的預后不良有關，見圖1B；NSCLC患者不同病理階段（Ⅰ～Ⅳ期）CPSF6 mRNA的表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1C；進一步分析肺腺癌和肺鱗癌的數據集，其中肺腺癌數據集包含483例癌組織和347例癌旁正常組織，肺鱗癌數據集包含486例癌組織和338例癌旁正常組織，結果顯示，在肺腺癌中，CPSF6 mRNA表達增高的患者OS較CPSF6 mRNA低表達的患者低（P＜0.05），存在不良預后，見圖1D、圖1E。

2.2 CPSF6在晚期NSCLC組織及正常肺組織中的表達情況? 免疫組化染色結果顯示，CPSF6主要位于肺癌細胞的細胞核上。74例患者中CPSF6表達增高占比63.51%（47/74），CPSF6低表達占比36.49%（27/74）。在正常的肺組織中，CPSF6均為低表達。晚期NSCLC組織中CPSF6的表達高于正常肺組織，差異有統計學意義（？字2=25.405，P＜0.05），見表1、圖2～圖5。

2.3 CPSF6的表達與晚期NSCLC患者臨床病理特征的關系? CPSF6的表達水平與晚期NSCLC患者的腫瘤大小、淋巴結轉移情況及臨床分期相關程度較高（P＜0.05），但與病理類型、年齡、性別、腫瘤分化程度無關（P＞0.05），見表2。

2.4 CPSF6、各臨床病理特征與NSCLC患者預后的關系? 采用 Kaplan-Meier 法進行單因素分析，選擇 Log-rank進行差異顯著性檢驗，結果發現CPSF6表達增高的患者較CPSF6低表達的患者PFS及OS短，差異有統計學意義（P＜0.05）。此外，腫瘤分期程度越高、合并有淋巴結轉移的患者PFS及OS均降低（P＜0.05）?；颊吣挲g、性別、病理類型、腫瘤大小、分化程度和患者預后無關（P＞0.05），見表3，圖6～圖11。Cox比例風險回歸模型多因素分析顯示，CPSF6的表達水平、淋巴結轉移和臨床分期均是NSCLC患者PFS及OS的獨立危險因素（P＜0.05）。

3討論

NSCLC侵襲性強，屬于惡性程度極高的腫瘤，其發病率及死亡率均處于惡性腫瘤的第1位[13]。提高NSCLC的早期診斷率是延長患者生存期的關鍵。本研究借助挖掘TIMER 2.0、TCGA數據庫中的肺癌數據集，篩選出目標基因CPSF6，發現NSCLC患者腫瘤組織中CPSF6 mRNA的表達水平高于癌旁組織，與多種癌癥患者的預后不良有關。相關研究證實，CPSF6在腫瘤的發生、發展中發揮著十分重要的作用。CPSF6在侵襲性乳腺癌中高度表達，并且是患者預后不良的臨床相關標志物[6，7]；該蛋白表達增高在肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲中也起著至關重要的推動作用。分析轉錄組范圍中的APA進程可以得知，CPSF6表達增高是保證細胞溶質黃素蛋白NQO1中的3′UTR近端poly（A）位點發揮作用的重要前提條件[8-10]；其次，CPSF6在胃癌中上調，敲低CPSF6可以導致胃癌細胞中基因的廣泛3′UTR縮短，并且其可以抑制胃癌細胞的增殖速度，暗示了CPSF6針對胃癌的潛在治療靶點[11]。CPSF6在食管鱗狀細胞癌組織中同樣升高，并且CPSF6表達增高與臨床病理參數如臨床分期和淋巴結轉移相關。CPSF6表達增高的食管癌患者與低表達組的患者相比，總生存期明顯降低，預后較差[12]。

CPSF6定位于人12號染色體上，也稱為CFIm68，分子量為68 kDa，是RNA切割和聚腺苷酸化處理所需的切割因子Im（CFIm）復合物亞基之一[12]。CFIm復合物是替代聚腺苷酸化（APA）的關鍵調節因子，APA是一種RNA轉錄后機制，用于產生可變的3'非翻譯區域（3'UTR），從而提高細胞的轉錄組復雜性[14，15]。相關研究表明[16-18]，APA在許多類型的腫瘤發生中起著關鍵作用，例如乳腺、腎臟、結腸、肝臟和肺部等部位的腫瘤。

本研究進一步通過免疫組化實驗檢測74例晚期NSCLC患者的病理標本，結果顯示CPSF6蛋白在晚期NSCLC組織中主要呈現高表達，在正常肺組織中主要呈現低表達，推測其可能參與了NSCLC的發生及進展過程，這也與TCGA數據庫分析結果相一致。另外，CPSF6表達上調與腫瘤大小、淋巴結轉移及臨床分期具有相關性，其在腫瘤直徑＞5 cm、臨床分期為Ⅳ期、有淋巴結轉移的患者中升高。Kaplan-Meier生存曲線顯示，CPSF6表達增高提示患者預后不良（P＜0.05），這與其他學者研究CPSF6在食管鱗癌患者中的作用結果類似[12]。NSCLC早期癥狀不明顯，患者在就診時往往已經處于疾病晚期，錯失外科手術的機會，導致其生存率低、預后差。Cox多因素回歸分析顯示，CPSF6蛋白高表達、淋巴結轉移和臨床分期均是影響患者預后的獨立危險因素，其他研究人員在乳腺癌[6，7]和肝細胞癌[8，9]的研究中也發現了CPSF6是判斷癌癥患者預后不良的相關標志物。分析本研究數據，CPSF6表達增高促進晚期NSCLC患者腫瘤侵襲同時降低患者預后的作用明確，但具體生物學機制目前尚不清楚。最新的研究表明[8]，CPSF6在APA進程中作為前mRNA切割和多聚腺苷酸化處理的激活劑，將前mRNA成熟為功能性mRNA。同時已經證實APA有助于肺癌中蛋白質代謝和腫瘤細胞運輸的協調。細胞增殖失調可歸因于癌變過程中細胞凋亡的抑制，體外和體內實驗表明，阻斷CPSF6表達對肺腺癌細胞增殖有顯著的抑制作用。該研究同樣發現PI3K/AKT信號通路是腫瘤發生的重要機制，在許多人類癌癥（包括肺腺癌）中經常失調，而CPSF6與PI3K/AKT通路之間存在密切的相關性。這也進一步提示了CPSF6在肺癌腫瘤機制中的潛在作用，與本研究中發現CPSF6表達增高與NSCLC預后較差相對應。

綜上所述，CPSF6在晚期NSCLC組織中的表達高于正常肺組織，其高表達與臨床分期、淋巴結轉移及腫瘤大小相關。CPSF6表達增高是晚期NSCLC患者的獨立風險因素，有助于預測晚期NSCLC患者的預后。

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收稿日期：2023-03-22；修回日期：2023-04-06

編輯/成森