PAI-1 和FV 基因多態性與靜脈血栓的臨床意義

陳晨 劉艷枚 曾汶烯 成彬 周美芳 尹衛國★

靜脈血栓由于血液非正常于深靜脈內凝結而產生，血栓脫落沿血流移動造成血栓栓塞，可導致腦卒中、冠心病等嚴重并發癥［1］。靜脈血栓的遺傳危險因素包括纖溶酶原激活物抑制劑-1（Active Plasminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1）和凝血因子V（Factor V，FV）。PAI-1 可滅活組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA），調節機體纖溶系統活性，PAI-1基因啟動子區-675 位5G 向4G 突變，導致PAI-1 含量或活性增加從而降低纖溶活性［2-3］。FVLeiden 點突變時凝血因子V 分子構象發生改變，導致活化蛋白質C（activated protein C，APC）滅活凝血因子的速率降低，產生APC 抗凝活性抵抗現象（activated protein C resistance，APCR），促凝與抗凝系統失衡，血栓形成［4-5］。本研究采用數字熒光分子雜交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）這一新興的分子細胞遺傳學技術，它是用已知的標記單鏈核酸為探針，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸，從而在染色體上定位靶基因。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2020 年4 月至2021 年8 月就診于清遠市人民醫院的住院患者2 281 例，平均年齡（62.38±15.15）歲，男性1 425 例，女性856 例。納入標準：因臨床需要或個人要求進行靜脈血栓相關基因檢測患者的標本數據；排除標準：因標本狀態不佳、實驗操作錯誤等原因檢測失敗患者的標本數據。本研究已通過豁免知情同意申請。本研究已獲得院倫理委員會批準（倫理審查批件號為IRB-2022-012）。

1.2 標本要求

EDTA 抗凝靜脈血2～3 mL，4℃低溫保存，保存時間不宜超過24 h。

1.3 試劑和儀器

測序反應通用試劑（25 μL/支，京大械備20150009 號）和核酸純化試劑（10 mL/瓶，京大械備20150010 號）由北京華夏時代基因科技發展有限公司提供，微量熒光檢測儀（Fluotec 48E）由西安天隆科技有限公司提供，sanger 測序儀（ABI 3730xl DNA Analyzer）由美國ABI 提供。

1.4 方法

1.4.1 實驗操作步驟

取150 uLEDTA 抗凝靜脈全血加到分裝有1.2 mL 1×NH4Cl 預處理液的EP 管中，上下顛倒10 次，室溫靜置5 min 以裂解紅細胞，液體顏色變為澄清紅色為準。室溫離心（3 000 rpm，5 min，離心半徑8 cm），棄上清，EP 管底沉淀加入1 mL 1×NH4Cl 預處理液以重懸白細胞，再次離心棄上清，沉淀加入50 μL核酸純化試劑，反復吹打混勻后室溫靜置30 min，待檢測。

1.4.2 符合率分析

采用數字熒光分子雜交法檢測5 個臨床樣本（s1-s5）PAI-1和FV基因型，采用“金標準”Sanger測序法進行符合率的性能驗證（先加盲再揭盲）。

1.4.3PAI-1和FV基因多態性分析

分析2 281 位患者PAI-1和FV基因型分布及等位基因頻率，了解男、女性和心、腦血管疾病、腫瘤患者基因多態性差異；收集心、腦血管疾病和腫瘤患者基線資料，比較三組PAI-15G5G 和5G4G/4G4G 基因型患者的臨床血液指標差異。

1.5 統計學分析

采用統計學軟件Grandpad 處理數據。計量資料采用（）表示，兩兩比較t檢驗，多組間比較采用方差分析。計數資料用n（%）表示，行χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 符合率比較

數字熒光分子雜交法與Sanger 測序結果完全一致，符合率達100%。見表1。

表1 方法符合率結果Table 1 Method compliance results

2.2 靜脈血栓相關基因PAI-1 和FV 基因多態性

PAI-1基因型分布符合遺傳平衡定律；FV基因極少突變，等位基因突變頻率僅為0.04%，多為野生純合型，FV基因型分布不符合遺傳平衡定律（P＜0.0001）。見表2。

表2 PAI-1 和FV 基因在人群中的總體分布［n（%）］Table 2 The overall distribution of PAI-1 and FV gene in the population［n（%）］

2.3 男女性靜脈血栓相關基因PAI-1 和FV 基因多態性

男、女性組PAI-1和FV基因型分布和等位基因頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3、表4。

表3 PAI-1 基因在男女性組分布［n（%）］Table 3 Distribution of PAI-1 gene in male and female groups［n（%）］

表4 FV 基因在男女性組分布［n（%）］Table 4 Distribution of FV gene in male and female groups［n（%）］

2.4 不同疾病患者靜脈血栓相關基因PAI-1 和FV 基因多態性表達差異

心血管疾病組、腦血管疾病組、腫瘤組和對照組這4 類患者PAI-1和FV基因型分布和等位基因頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5、表6。

表5 PAI-1 基因在不同疾病中的多態性分布［n（%）］Table 5 Polymorphism distribution of PAI-1 gene in different diseases［n（%）］

表6 FV 基因在不同疾病中的多態性分布［n（%）］Table 6 Polymorphism distribution of FV gene in different diseases［n（%）］

2.5 臨床基線資料分析

心血管疾病組、腦血管疾病組和腫瘤組的年齡、吸煙史、高血壓史、冠心病史、血紅蛋白、血小板、隨機血糖、纖維蛋白原、凝血酶時間、D 二聚體、甘油三酯、低密度脂蛋白比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表7。

表7 心、腦血管和腫瘤疾病的臨床資料比較［（），n（%）］Table 7 Comparison of Clinical Data of Cardiovascular，Cerebrovascular and Tumor Diseases［（），n（%）］

2.6 PAI-1 基因與臨床資料相關性

心血管疾病組、腦血管疾病組和腫瘤組PAI-15G5G 和5G4G/4G4G 基因型患者的多項臨床血液指標表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表8。

表8 三組PAI-1 5G5G 和5G4G/4G4G 基因型患者的臨床血液指標比較（）Table 8 Comparison of clinical blood indexes in three groups of patients with PAI-1 5G5G and 5G4G/4G4G genotypes（）

表8 三組PAI-1 5G5G 和5G4G/4G4G 基因型患者的臨床血液指標比較（）Table 8 Comparison of clinical blood indexes in three groups of patients with PAI-1 5G5G and 5G4G/4G4G genotypes（）

3 討論

藥物基因檢測可預測患者對于不同藥物的療效和不良反應的程度，對臨床用藥起到一定的指導作用［6］。本研究采用微量熒光檢測儀檢測臨床標本靜脈血栓PAI-1和FV基因，同時將臨床標本加盲再揭盲進行Sanger 測序法驗證，發現兩種檢測方法結果完全符合。

PAI-1 抑制活性纖溶酶的產生而促進血栓形成，在心腦血管疾病和腫瘤進展中起著關鍵作用［7-8］，PAI-1 不僅影響血漿纖溶和凝血系統平衡，而且在實體腫瘤侵襲、浸潤和轉移中發揮重要作用。PAI-1基因多態性與阿爾茨海默病、代謝綜合征及癌癥風險有一定關聯［9-10］，PAI-1基因的過度表達可導致血栓風險增高，4G5G/4G4G 等位基因攜帶者PAI-1 表達水平較高［11］，4G5G、4G4G 發生靜脈血栓的風險分別是5G5G 型（正常纖溶型）的4.85、6.35 倍。本研究發現說明PAI-1基因多態性與性別及疾病類型并無明顯相關性，PAI-1基因多態性可能是靜脈血栓的遺傳風險因素。

FV Leiden 突變是靜脈血栓常見的遺傳危險因素［12］，而FV Leiden 突變因種族群體而異，部分人群中少見FV Leiden 突變［13］。本研究結果說明本地區FV基因檢測缺乏一定的臨床藥物指導意義，考慮棄除FV基因臨床檢測項目，不再將其納入臨床常規檢測。這和已有研究符合，FV基因突變在亞洲地區極為罕見［14］。

分析本研究結果進一步分析PAI-1基因與臨床資料相關性時，發現心、腦血管疾病組和腫瘤組PAI-15G5G 和5G4G/4G4G 基因型患者的各項臨床指標的表達差異均無統計學意義。由此說明PAI-1基因多態性與心、腦血管和腫瘤組患者疾病進程并無明顯相關性，推測PAI-1基因多態性可能是靜脈血栓發生發展的獨立危險因素［15］，檢測PAI-1基因可能有助于靜脈血栓的初級預防。

此次研究仍存在一定局限性：①臨床疾病種類有待豐富和更加細化；②各組別樣本量相對不足；③介于本研究僅對存在靜脈血栓高危風險并有給藥需求的患者方可申請本檢測項目，故而正常對照組以未有基礎疾病人群數據進行分析。

綜上所述，本實驗室熒光原位雜交技術可替代Sanger 測序以檢測靜脈血栓PAI-1和FV基因多態性，結果可信并為臨床治療提供準確依據。PAI-1基因多態性可能是靜脈血栓發生發展的獨立危險因素，有助于靜脈血栓的初級預防、治療和預后。藥物基因檢測可以協助臨床醫生在藥品選擇、劑量控制及聯合用藥等方面早日實現個體化用藥的精準醫療。