三痹顆粒治療類風濕性關節炎的臨床觀察及網絡藥理學研究

鄒滔 謝湘雄 禹勇軍 梁權兵

摘要：目的? 觀察三痹顆粒治療類風濕性關節炎（RA）的臨床療效，并采用網絡藥理學對其作用機制進行初探。方法? 選取2021年1月-2022年12月婁底市中醫醫院收治的RA患者96例，隨機分為研究組（48例）和對照組（48例），對照組給予常規藥物治療，研究組在此基礎上給予三痹顆粒治療，比較兩組治療2個月后臨床療效及血清指標[紅細胞沉降率（ESR）、C-反應蛋白（CRP）、類風濕因子（RF）、抗環瓜氨酸肽抗體（ACPA）及白細胞介素-6（IL-6）]。另基于網絡藥理學方法，首先利用TCMSP數據庫數據庫篩選三痹顆粒的有效成分和作用靶點，將結果在Gene Cards數據庫中檢索抗RA相關靶點，求交集獲得關鍵核心靶點；其次，借助STRING數據庫進行蛋白互作分析，通過DAVID數據庫進行基因本體論（GO）功能和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析；最后，利用Cytoscape 3.6.1軟件構建蛋白互作和“活性成分-靶點-通路”網絡。結果? 治療組總有效率為96.50%，高于對照組的68.75%（P＜0.05）；治療組治療后2個月后ESR、CRP、RF、ACPA、IL-6水平優于對照組（P＜0.05）。網絡藥理學研究分析得到21個關鍵活性成分和27個潛在靶點，主要通過10條關鍵信號通路發揮抗RA作用。結論? 三痹顆粒治療RA具有多成分、多靶點、多通路的協同干預作用特點，能有效改善RA患者臨床癥狀，臨床效果確切。

關鍵詞：三痹顆粒；類風濕性關節炎；網絡藥理學

中圖分類號：R593.22? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.003

文章編號：1006-1959（2024）04-0014-07

Clinical Observation and Network Pharmacology Study on the Treatment of Rheumatoid Arthritis

with Sanbi Granule

ZOU Tao1，XIE Xiang-xiong1，YU Yong-jun1，LIANG Quan-bing2

（Department of Pharmacy1，Acupuncture Rehabilitation Center2，Loudi Hospital of Traditional Chinese Medicine，

Loudi 417000，Hunan，China）

Abstract：Objective? To observe the clinical efficacy of Sanbi Granules in the treatment of rheumatoid arthritis （RA）， and to explore its mechanism of action by network pharmacology.Methods? A total of 96 patients with RA treated in the Loudi Hospital of Traditional Chinese Medicine from January 2021 to December 2022 were selected and randomly divided into study group （48 patients） and control group （48 patients）. The control group was given conventional drug treatment， and the research group was given Sanbi granules on the basis of this treatment. The clinical efficacy and serum indexes [erythrocyte sedimentation rate （ESR）， C-reactive protein （CRP）， rheumatoid factor （RF）， anti-cyclic citrullinated peptide antibody （ACPA） and interleukin-6 （IL-6）] were compared between the two groups after 2 months of treatment. Based on the network pharmacological method， first， the effective components and targets of Sanbi granules were screened with TCMSP database， the key core targets were obtained by intersection of the results and the anti-RA related targets retrieved from Gene Cards databases. Secondly， STRING database was used for protein interaction analysis， protein interaction and active components-targets-pathway network was constructed by Cytoscape 3.6.1. Finally， gene ontology （GO） function and KEGG pathway enrichment analysis were performed by DAVID database， and the above results were verified by molecular docking technique.Results? The total effective rate of the treatment group was 96.50%， which was higher than 68.75% of the control group （P<0.05）. The levels of ESR， CRP， RF， ACPA and IL-6 in the treatment group were better than those in the control group 2 months after treatment （P<0.05）. Through network pharmacology analysis， 21 key active components and 27 potential targets were obtained， which mainly played an anti-RA role through 10 key signaling pathways.Conclusion? Sanbi granules have the characteristics of multi-component， multi-target and multi-pathway synergistic intervention in the treatment of RA， which can significantly improve the clinical symptoms of RA patients and the clinical effect is remarkable.

Key words：Sanbi granule;Rheumatoid arthritis;Network pharmacology

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）一種最常見的自身免疫疾病，易反復發作，早期以關節疼痛、腫脹及功能受限為特征，后期發展導致各關節畸形及功能受限，對患者家庭及社會造成沉重負擔[1，2]。當前臨床上通常使用非甾體抗炎類藥物來控制疾病，但是此類藥物不良反應較大，且不能長期使用，導致治療效果與患者依從性較差[3]。RA屬中醫“痹癥”范疇，《黃帝內經》記載：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也”。中醫藥在RA的治療中具有療效確切、副作用小、價格便宜等特點，與化藥治療相比優勢顯著[4]。三痹顆粒為婁底市中醫醫院臨床驗方，主要由黃芪、人參、當歸、川芎等16味中藥組成，具有益氣活血、除濕通絡等功效，臨床上常用于RA的治療。但目前三痹顆粒在RA治療中臨床療效和安全性循證證據不足，并且其治療RA的潛在作用機制也有待明確。網絡藥理學可運用數據庫和計算機軟件，構建“中藥-有效成分-靶點-通路”網絡以揭示其復雜藥理機制，與傳統的單靶點作用模式相比，更適合研究中藥復方的復雜應用[5，6]。因此，本研究搜集三痹顆粒在RA中的臨床效果信息，并利用網絡藥理學方法初步闡明三痹顆粒在RA中的關鍵藥效物質與潛在作用機制，為后續該方的進一步應用和推廣提供科學依據。

1資料與方法

1.1臨床對照試驗

1.1.1一般資料? 選取2021年1月-2022年12月就診于婁底市中醫醫院的RA患者96例，按照隨機數字表法分為研究組（48例）和對照組（48例）。研究組男11例，女37例，年齡26～71歲，平均年齡（42.32±5.46）歲；病程3個月～21年，平均病程（15.32±3.79）年。對照組男10例，女38例，年齡25～72歲，平均年齡（42.14±6.21）歲；病程3個月～22年，平均病程（15.09±4.22）年。兩組性別、年齡和病程比較，差異無統計學意義（P>0.05），資料均衡可比。本研究已經得到醫院倫理委員會的批準，并得到患者的知情同意，同時也簽署了知情同意書。

1.1.2診斷標準? 所有入選患者均符合2010年美國風濕病學會（American College of Rheumatology，ACR）/歐洲抗風濕聯盟（European League Against Rheumatism，EULAR）發布的RA西醫分類標準。中醫診斷標準與《中藥新藥臨床研究指導原則》RA寒濕痹阻證的辨證標準一致，其主要證候：關節脹痛、遇冷痛劇、清晨僵直、屈伸不暢、局部喜溫涼；次癥：乏力、口不渴、寒冷和天氣變化增加、四肢沉重等；舌脈：舌質淡、苔薄，脈弦細、浮或沉[7]。

1.1.3納入及排除標準? 納入標準：符合上述診斷標準，患者1個月內未使用非甾體類抗炎藥等抗風濕藥物。排除標準：合并有其它風濕病的患者；疾病晚期，關節嚴重畸形或并發癥嚴重；妊娠及哺乳期女性；有嚴重基礎疾病的患者，如嚴重心肺功能不全、肝腎功能嚴重受損等；正在參與其它藥物臨床試驗者；過敏體質者。

1.1.4治療方法? 對照組患者口服甲氨蝶呤片（上海上藥信誼藥廠有限公司，國藥準字H31020644，規格：2.5 mg/片），10 mg/次， 1次/周。研究組在對照組服藥基礎上加用三痹顆粒（本院制劑室生產，組成：黃芪30 g、人參3 g、續斷15 g、細辛3 g、杜仲15 g、防風10 g、肉桂5 g、茯苓15 g、白芍15 g、炙甘草10 g、生地15 g、川芎10 g、川牛膝15 g、紅花10 g、伸筋草15 g、當歸15 g），溫水沖服，2次/d。

1.1.5觀察指標? 治療2個月后，比較兩組臨床療效及血清指標。臨床療效：根據病情的嚴重程度，證候積分可以被分類為無、輕、中、重度。主要癥狀的評分分別是0、2、4、6分，而次要癥狀的評分則是0、1、2、3分。顯效為明顯改善了患者的中醫臨床癥狀和體征，同時證候積分減少不少于70%；有效為改善了患者的中醫臨床癥狀和體征，證候積分減少在30%～70%；無效為沒有改善或者加重了患者的中醫臨床癥狀和體征，證候積分減少小于30%。血清指標：采用魏氏法檢測紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）；采用膠乳增強免疫比濁法檢測類風濕因子（rheumatoid factor，RF）和C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）；采用ELISA法檢測抗環瓜氨酸肽抗體（anti-cyclic citrullinated peptide antibody，ACPA）和白細胞介素-6（IL-6）。

1.1.6統計學方法? 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，采用t檢驗分析計量資料，以（x±s）表示，采用？字2檢驗分析計數資料，以（n，%）表示，其中P＜0.05為差異有統計學意義。

1.2網絡藥理學分析

1.2.1三痹顆?；瘜W成分和作用靶點篩選? 通過TCMSP數據庫對三痹顆粒處方中的化合物進行檢索，在“Related Targets”頁面導入化合物的編號，獲得其靶標蛋白。在Uniport數據庫（https：//www.uniprot.org/）中導入獲取的化合物靶點資料，采用STRING（https：//string-db.org/）中Multiple proteins和 UniProt（http：//www.uniprot.org/）中UniProtKB搜索功能，進行標準化得到結果。從Gene Cards數據庫（https：//www.genecards.org/）檢索類風濕性關節炎的相關靶點并將其結果引入Excel中，與處方成分靶點共同引入Venny 2.1.0數據庫（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）映射，記錄兩者的交集部分，并繪制韋恩圖。

1.2.2蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建? 將上述篩選所得到潛在靶點輸入STRING數據庫（https：//bioinformatics.com.cn/），置信度為0.09，獲取交集靶點的PPI網絡圖，并利用Cytoscape 3.9.1軟件中CytoNCA插件對網絡圖進行繪制。

1.2.3 靶點基因功能與靶點通路富集分析? 將篩選出的三痹顆粒潛在靶點導入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數據庫，設定物種條件為“Homo sapiens”，采取基因本體論（GO）功能和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，設定閾值P＜0.05，再用GraphPad Prism 8.0將結果可視化。

1.2.4“活性成分-靶點網絡-通路”網絡的構建? 利用Cytoscape 3.9.1軟件，構建處方“成分-靶點-通路”網絡，分析化合物和靶點間的度（degree）值關系，其中節點代表化學成分、靶點和信號通路，邊用來連接化學成分、靶點和信號通路。

2結果

2.1臨床觀察結果

2.1.1兩組臨床療效比較? 治療2個月后，研究組臨床總有效率高于對照組（P＜0.05），見表1。

2.1.2兩組治療前后血清指標比較? 治療2個月后，兩組ESR、CRP、RF、ACPA、IL-6水平優于治療前，且研究組優于對照組（P＜0.05），見表2。

2.2網絡藥理學研究結果

2.2.1三痹顆?；瘜W成分及其作用靶點的搜集? 通過TCMSP獲取三痹顆粒處方332個無重復靶點，通過Gene Cards查詢獲得抗RA作用靶點2787個無重復靶點。通過在線韋恩圖可知，處方中化合物與抗RA作用的交集基因有191個，分別為IL6、TNF、CRP等，借助Venny 2.1.0將結果可視化，結果見圖1。

2.2.2 PPI網絡圖的構建及核心靶點篩選? 將上述韋恩圖結果中的交集靶點輸入到STRING數據庫，獲取靶點相互作用的網絡關系數據，隨后將其導入Cytoscape 3.9.1軟件，建立PPI蛋白網絡圖（圖2），網絡含有157個節點和778條邊（剔除5個游離靶點）。利用Cytoscape 3.9.1軟件中CytoNCA插件對網絡圖進行分析，獲取處方治療濕疹的核心靶點，degree值排名前10的核心靶點分別是AKT1、TP53、MAPK3、MAPK1、RELA、TNF、MAPK14、ESR1、FOS、IL6。

2.2.3 GO功能和KEGG通路富集分析? 通過GO功能富集分析，共獲得GO條目387個，包括生物過程（biological process）條目315個，涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、基因表達的正調控、DNA轉錄的正調控等；細胞組成（cellular component）條目20個，涉及核質、細胞質、細胞溶膠等；分子功能（molecular function）條目52個，涉及酶結合、蛋白結合、轉錄因子等，見圖3。通過KEGG通路富集分析，共獲得143條信號通路，涉及MAPK、Dectin-1、TNF、IL-17、Toll樣受體信號通路等，排名前10個通路的氣泡圖見圖4。

2.2.4處方“成分-靶點-通路”網絡的構建? 該網絡由58個節點（包含21種活性成分、27個靶點、10個關鍵通路節點）和183條邊，其中化學成分槲皮素、漢黃芩素、木犀草素等節點較大，提示這些成分可能是三痹顆粒的主要活性成分，另外MAPK14、AKT1、RELA等靶點節點較大，提示這些靶點可能是三痹顆粒發揮治療作用的關鍵靶點，見圖5。

3討論

RA是以關節損傷為主的慢性自身免疫性疾病之一，其病因和發病機制尚不十分清楚，臨床治療主要是控制癥狀和延緩病情。中醫學把RA歸屬痹癥范疇，治以溫經散寒、祛風除濕。三痹顆粒是婁底市中醫院臨床驗方，本方以人參、黃芪補氣為君藥，當歸、川芎、白芍、紅花補血活血為臣藥，佐以防風、細辛、茯苓等伸筋草之類以祛風除濕，肉桂、續斷、牛膝以補腎散寒，使以炙甘草與諸藥調和，諸藥配伍共奏溫經散寒、祛風除濕之功效。

臨床上通常采用RF和ACPA對RA進行診斷分類，CRP和ESR水平是判斷RA病情活動度和評價治療效果的重要指標，促炎因子IL-6與RA的疾病活動、發展變化和治療效果密切相關。本臨床研究結果顯示，研究組治療2個月后總有效率高于對照組（P＜0.05）；研究組和對照組治療2個月后RF、ACPA、ESR、CRP、IL-6水平均低于治療前，且研究組優于對照組（P＜0.05），提示寒濕痹阻型RA患者通過服用三痹顆粒能夠有效改善其臨床癥狀，同時可降低ESR、CRP、RF、ACPA及IL-6水平，延緩病情進展。此外，本研究通過網絡藥理學方法篩選三痹顆粒中活性成分靶點，發現槲皮素、漢黃芩素、木犀草素連接的靶點較多，是治療RA的潛在關鍵藥效成分，且這三種成分均為黃酮類化合物，這可能與黃酮類化合物抗炎和抗氧化的作用機制有密切關系[8，9]。槲皮素廣泛分布于植物的各個部位，且生物學活性多樣化，如消除炎癥及微生物、抗過敏和防止糖尿病并發癥等[10，11]。研究表明[12]，槲皮素能降低RA實驗模型炎癥，表現出對肝臟的保護作用；同時，其能有效降低RA成纖維滑膜細胞炎癥因子和基質金屬蛋白酶表達，其作用機制可能與抑制NF-κB表達有關[13]。漢黃芩素常用于治療一些過敏性和炎癥性疾病[14]。研究發現[15]，漢黃芩素能抑制氧化應激和炎癥因子的侵襲，對RA有預防作用。而木犀草素可通過抑制滑膜中炎性細胞因子和基質水解酶的表達發揮RA的治療作用[16]。

另外，本研究中三痹顆粒治療RA靶點PPI網絡顯示，AKT1、TP53、MAPK3、MAPK1、RELA、TNF、MAPK14、ESR1、FOS、IL6等27個靶點是三痹顆粒治療RA的關鍵靶點。各種炎性細胞浸潤、滑膜細胞增生、血管翳生成、及骨組織損傷是RA的主要病理特點[17]。有研究顯示[18]，AKT在RA滑膜細胞中高表達，故認為AKT與RA成纖維樣滑膜細胞過度增殖可能呈正相關。TP53在RA滑膜來源的間充質干細胞中表達下調[19]，TP53能顯著減輕佐劑誘導的關節炎大鼠滑膜炎，降低IL-6水平[20]。IL-6在免疫應答、造血和中樞神經系統中都扮演著關鍵角色，RA患者血清和滑膜腔內IL-6的濃度與其疾病的活躍性緊密相連[21-23]。本研究通過GO富集分析及KEGG通路富集分析，初步得到三痹顆粒主要通過MAPK、C-type lectin receptor、TNF等途徑來對RA進行治療的。TNF是經典細胞因子通路之一，可調控RA患者的破骨細胞、成骨細胞和滑膜細胞的功能，通過激發炎性細胞因子生成、滑膜增殖、血管翳生成，以及破壞骨和軟骨，從而導致RA的產生，因此它是治療RA的關鍵目標路徑之一[24-27]。

綜上所述，三痹顆粒能夠有效改善寒濕痹阻型RA患者的臨床癥狀及體征，其治療RA的關鍵藥效物質為槲皮素、漢黃芩素、木犀草素，抗RA的作用機制與MAPK、C-type lectin receptor、TNF通路相關。

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收稿日期：2023-04-12；修回日期：2023-04-25

編輯/杜帆