基于網絡藥理學與分子對接探討黃芪-丹參治療肝纖維化的作用機制

趙一鵬 繆玲 鐘亞玩 徐坤敏 黃娜娜 周云松 胡芳

摘要：目的? 通過網絡藥理學與分子對接研究黃芪-丹參治療肝纖維化作用機制。方法? 利用TCMSP數據庫平臺對黃芪、丹參有效成分及其相關作用靶點進行篩選；利用GeneCards和OMIM數據庫平臺對肝纖維化作用靶點進行篩選。利用Cytoscape軟件構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖，運用String和David數據庫對靶點進行PPI網絡、GO生物過程與KEGG通路分析。通過AutoDock Vina對成分和靶點進行分子對接。結果? 黃芪-丹參中共獲得有效成分76個，與肝纖維化對應的靶點64個；GO生物過程102條，信號通路155條，主要涉及的信號通路有糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路等。分子對接顯示黃芪、丹參中槲皮素、木犀草素、山柰酚和丹參酮ⅡA等與核心靶點AKT1、TP53、VEGFA、TNF、IL-6均具有較好的親和力。結論? 黃芪-丹參治療肝纖維化的作用機制具有“多成分、多靶點、多信號通路”的特點，為今后的實驗研究提供了參考依據。

關鍵詞：黃芪-丹參；肝纖維化；網絡藥理學；分子對接

中圖分類號：R575? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.004

文章編號：1006-1959（2024）04-0021-06

The Mechanism of Huangqi-Danshen in the Treatment of Liver Fibrosis

Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

ZHAO Yi-peng1，MIAO Ling2，ZHONG Ya-wan2，XU Kun-min2，HUANG Na-na2，ZHOU Yun-song2，HU Fang2

（1.The Second Clinical Medical College of Guizhou University of Chinese Medicine，Guiyang 550000，Guizhou，China;

2.Department of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Chinese Medicine，

Guiyang 550000，Guizhou，China）

Abstract：Objective? To study the mechanism of Huangqi-Danshen in the treatment of liver fibrosis by network pharmacology and molecular docking.Methods? The TCMSP database platform was used to screen the effective components and related targets of Huangqi and Danshen. GeneCards and OMIM database platforms were used to screen the targets of liver fibrosis. Cytoscape software was used to construct the "drug-component-disease-target" network diagram， and String and David databases were used to analyze the PPI network， GO biological process and KEGG pathway of the targets. Molecular docking of components and targets was performed by AutoDock Vina.Results? A total of 76 active ingredients and 64 targets corresponding to liver fibrosis were obtained from Huangqi-Danshen. There were 102 GO biological processes and 155 signaling pathways. The main signaling pathways involved were AGE-RAGE signaling pathway， IL-17 signaling pathway， TNF signaling pathway， and hypoxia-inducible factor 1 （HIF-1） signaling pathway in diabetic complications. Molecular docking showed that quercetin， luteolin， kaempferol and tanshinone ⅡA in Radix Astragali and Radix Salviae Miltiorrhizae had good affinity with core targets AKT1， TP53， VEGFA， TNF and IL-6.Conclusion? The mechanism of Huangqi-Danshen in the treatment of liver fibrosis has the characteristics of "multi-component， multi-target and multi-signal pathway"， which provides a reference for future experimental research.

Key words：Huangqi-Danshen;Liver fibrosis;Network pharmacology;Molecular docking

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是指在各種病因的作用下，肝星狀細胞（heapatic stellate cell，HSC）被誘導激活為肌成纖維細胞（myofibroblast，MFP），并且導致肝細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）產生和降解之間的不平衡，導致正常肝功能受損，最后引起肝纖維化[1]。慢性肝炎、脂肪肝以及其他一些肝臟疾病都可發展成為肝硬化甚至肝癌，因此對肝纖維化進行早期診斷與治療具有很重要意義。最新資料表明[2]，全世界每年約有2百萬人死于肝病，其中肝硬化，肝癌為終末期肝病死亡的重要原因；肝硬化致死率由第13位增加到第11位，肝癌致死率由20位增加到16位。由于肝臟疾病具有高復發率、低死亡率等特點，因而越來越引起醫學界重視。我國肝病患者約有3千萬人，肝硬化在全世界范圍內死亡人數為11%[3]；隨著社會老齡化程度的增加以及生活方式的改變，我國肝臟疾病發病率呈逐年增長趨勢。肝纖維化在各種慢性肝病進展至終末期肝病的進程中起著至關重要的作用，因此早期干預肝纖維化是預防慢性肝病發展為終末期肝病的一種有效手段。近年來中醫藥抗肝纖維化研究結果備受關注，中藥具有多層次、多靶點、多途徑的藥理作用表現出更大優越性，引起了國內外專家學者的重視[4]。氣虛血瘀為肝纖維化的基本病機，因此對肝纖維化治療以益氣活血為主。黃芪、丹參分別為益氣，活血之要品，為中醫益氣活血類常配伍藥。本文擬以網絡藥理學的思想和方法為依托，探討黃芪-丹參有效成分、作用靶點以及通路間關系，研究黃芪-丹參抗肝纖維化作用機制，以期為肝纖維化臨床治療提供參考依據。

1資料與方法

1.1黃芪-丹參有效成分、靶點篩選? 利用中藥系統藥理學分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP）獲取黃芪、丹參有效成分與靶點，以OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，通過UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）對靶點進行標準化處理。

1.2肝纖維化靶點篩選? 利用Genecards數據庫（http：//www.genecards.org/）、人類孟德爾遺傳（OMIM）在線數據庫（http：//www.omim.org/），以“hepatic fibrosis”作為檢索詞，尋找肝纖維化疾病靶點。其中，在GeneCards數據庫中以相關性分數≥10為篩選條件。

1.3藥物-成分-疾病-靶點網絡構建? 將藥物、有效成分、疾病與作用靶點進行整理，通過Cytoscape（http：//www.cytoscape.org/）構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡。

1.4 PPI網絡構建? 在STRING數據庫（https：//string-db.org/）中導入黃芪-丹參治療肝纖維化的作用靶點，以“Homo sapiens”為篩選條件獲取核心靶點，通過Cytoscape 3.9.1（http：//www.cytoscape.org/）構建蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡圖。

1.5 GO生物過程和KEGG通路富集分析? 在David數據庫（https：//dvid.ncifcrf.gov/）對共同靶點進行基因本體（gene ontology，GO）生物過程與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。其中，篩選條件P＜0.05，對P值位于前15的通路進行可視化分析。

1.6分子對接? 將PPI網絡利用NetworkAnalyzer進行拓撲分析，通過“degree”的方式排序，將基因分值位于前5的靶點選取為受體，將黃芪-丹參核心成分選取為配體，通過AutoDock Vina將受體和配體進行對接，結果以最低結合能進行比較。

2結果

2.1黃芪-丹參有效成分、靶點的篩選? 在TCMSP數據庫中對黃芪、丹參進行檢索，分別獲得17個和59個有效成分，共76個有效成分，通過數據庫獲取作用靶點247個，并通過Uniprot數據庫進行標準化處理。

2.2黃芪-丹參治療肝纖維化的作用靶點? 在Genecards數據庫和OMIM數據庫中分別輸入“hepatic fibrosis”進行檢索，獲得589個疾病靶點。通過Venny2.1軟件獲得黃芪-丹參有效成分與肝纖維化的共同靶點64個，見圖1。

2.3藥物-成分-疾病-靶點網絡? 通過Cytoscape軟件構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡，獲得247個藥物靶點，589個疾病靶點，64個共同靶點，見圖2。結果顯示，槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮ⅡA等在網絡中起著關鍵作用，說明這些成分可能是治療肝纖維化的核心成分。

2.4黃芪-丹參治療肝纖維化靶點PPI網絡? 在String數據庫中對藥物疾病共同靶點進行PPI分析，然后導入Cystoscap，獲得PPI網絡，涉及64個節點、1167條邊，見圖3。其中，絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、細胞腫瘤抗原p53（TP53）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素6（IL-6）的度值明顯高于其他靶點，說明它們在PPI網絡中具有重要作用。

2.5 GO生物過程和KEGG通路富集分析? 將藥物與疾病64個共同靶點導入David數據庫，進行GO生物過程和KEGG通路分析。以P＜0.05為篩選條件，選取P值較小的前15個進行氣泡圖可視化。獲得GO條目102個，主要涉及細胞因子受體結合、細胞因子活性、信號受體激活劑活性、受體配體活性、DNA結合轉錄因子結合、血紅素結合等生物過程，見圖4。獲得信號通路155條，主要涉及糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路等，見圖5。

2.6分子對接? 通過PPI網絡，選取度值較大的5個作用靶點和4個有效成分進行分子對接，通過對接分值選擇最優構型，見表1。平均對接分值-7.06 kcal/mol，其中，丹參酮ⅡA（tanshinone iia）和TNF對接分值-8.32 kcal/mol，槲皮素（quercetin）和VEGFA對接分值-8.15 kcal/mol，見圖6、圖7。

3討論

近年來，隨著人類物質文明和生活方式的高度發展，人類的疾病譜已經變的錯綜復雜，然而這些復雜疾病在發生和發展中常涉及“多臟腑、多靶點、多基因及多信號通路”。網絡藥理學具有“多靶點、多信號通路”的特點，中藥具有多成分、多靶點、多通信號路的作用，與當前的疾病治療理念相符合，因此研究中藥與多成分、多靶點、多通路的相關性，對于闡述疾病發病機制和治療靶點具有重要價值。

本研究發現槲皮素、木犀草素、山柰酚和丹參酮ⅡA為黃芪-丹參的主要有效成分，可以作用于大量的肝纖維化靶點，它們都屬于黃酮類化合物，主要存在于自然界，具有抗炎、抗氧化等作用[5]。蔣煒等[6]研究發現，槲皮素對體外培養的HSC具有明顯的調控作用。陳文龍等[7]研究發現，在CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型中，榭皮素具有明顯的保護作用。Ma JQ等[8]研究發現，槲皮素能夠降低細胞色素P450 2E1和促炎標志物的表達。Cummins CB等[9]研究發現，木犀草素能夠誘導HSC凋亡，下調α-平滑肌肌動蛋白表達。Xu T等[10]研究發現，山柰酚可抑制膠原蛋白的合成和HSC的活化。丹參酮ⅡA能夠抑制TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4表達，激活Smad7表達，從而抑制HSC的活化[11-13]。以上研究表明，黃芪-丹參的有效成分對肝纖維化的治療是有效的，具有重要的研究價值。

PPI網絡分析中發現，度值比較高的蛋白是AKT1、TP53、VEGFA、TNF、IL-6，說明這些可能為治療肝纖維化的重要靶點。AKT1屬于AKT激酶之一，Akt1可抑制HSC的活化，抑制促肝纖維化標志物的表達[14]。TP53屬于肝癌的啟動基因，如果伴有乙型肝炎病毒感染，更易發展為肝硬化[15]。VEGFA能夠誘導肝臟內的血管新生，以及內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞的增殖等[16]。TNF來源于巨噬細胞和免疫細胞，具有調節免疫的能力，不僅是免疫系統主要的調節成分，也是炎癥性疾病治療的主要手段，但如果機體受到感染或組織受到損傷時其又會被激活，誘導和維持炎癥的發生[17，18]。此外，TNF具有細胞毒性作用，可誘導腫瘤發生[19]。IL-6是重要的炎癥因子，能夠誘導肝細胞的炎癥反應，導致肝細胞受損以及纖維組織增生，使得慢性炎癥持續發展[20]?？梢?，肝纖維化的發生、發展離不開這些靶點，主要涉及HSC的活化、肝纖維化標志物的表達、血管新生、細胞增殖以及炎癥因子表達等。

GO生物過程主要涉及細胞因子受體結合、細胞因子活性、信號受體激活劑活性、受體配體活性、DNA結合轉錄因子結合等，對于黃芪-丹參治療肝纖維化具有重要意義。通過KEGG分析發現IL-17信號通路、TNF信號通路和缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路是治療肝纖維化的特征性信號通路。IL-17在病毒性肝炎、酒精性肝病以及自身免疫性肝炎中呈高表達狀態。IL-17A可以通過激活Kupffer細胞與HSC導致IL-6、TNF-α與TGF-β1產生。IL-17還能夠通過STAT3誘導 HSC活化增值。在肝纖維化小鼠中，敲除IL-17A與IL-17RA的小鼠，肝纖維化明顯減輕[21，22]。TNF-α能夠抑制活化的HSC增殖和MMP產生。TNF-α還可以誘導肝內皮細胞和核因子相關細胞因子κB的激活，對肝細胞造成炎性損傷[23]。有文獻報道[24]，在各種肝纖維化模型中，HIF-1α的表達均顯著高于正常組，且肝纖維化程度越嚴重，HIF-1α的表達也越高。研究發現[25]，在肝纖維化模型中，通過敲除HIF-1α，VEGF的表達會下降，說明HIF-1α可調控VEGF的表達而導致肝纖維化。

最后，分子對接結果顯示，黃芪-丹參主要的有效成分槲皮素、木犀草素和山柰酚與丹參酮ⅡA等與核心靶點AKT1、TP53、VEGFA、TNF、IL-6能夠很好地結合，對網絡藥理學結果的準確性進行了進一步驗證。

本研究基于網絡藥理學和分子對接，初步闡述黃芪-丹參藥對治療肝纖維化可能涉及多成分、多靶點、多信號通路等，豐富了治療肝纖維化的理論基礎，為后續的實驗研究提供了參考思路。

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收稿日期：2023-04-13；修回日期：2023-04-25

編輯/王萌